p38γ在人腦星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)及生物學(xué)意義的研究.pdf

1、背景:作為最常見(jiàn)的神經(jīng)上皮性腫瘤，星形細(xì)胞瘤通常具有無(wú)限增殖和侵襲性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，盡管目前已有多種治療手段，但該病的整體預(yù)后仍欠佳，因而仍有必要深入研究其腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制以尋找新的有效治療靶點(diǎn)。p38γ是p38 MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）的四個(gè)亞型之一，正常情況下僅表達(dá)于骨骼肌組織。近年來(lái)的一些研究發(fā)現(xiàn)p38γ可能參與一些潛在的細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的調(diào)節(jié)過(guò)程，表明其在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展過(guò)程中潛在的致瘤性，但具體作用機(jī)制仍然不明。目前國(guó)內(nèi)外

2、尚未有研究揭示p38γ在人腦星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)情況及其對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的影響。
　　目的:探討p38γ在人腦星形細(xì)胞瘤組織中的表達(dá)情況及與各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。構(gòu)建沉默人p38γ基因表達(dá)的siRNA序列并篩選出有效siRNA序列，為后續(xù)體外實(shí)驗(yàn)研究p38γ的生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)。探討p38γ對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、凋亡、遷移、侵襲等多種生物學(xué)特性的影響及相關(guān)的作用機(jī)制。
　　方法:標(biāo)準(zhǔn)化采集61例人星形細(xì)胞瘤和5例非腫瘤性腦組

3、織標(biāo)本，分別用Western blot及免疫組化法檢測(cè)前述標(biāo)本中p38γ和hTERT蛋白的表達(dá)差異，分析p38γ表達(dá)水平與星形細(xì)胞瘤患者各項(xiàng)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系。設(shè)計(jì)針對(duì)p38γ的siRNA片段（3對(duì)），借助Lipofectamine TM2000轉(zhuǎn)染入人膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，使用熒光定量Realtime-PCR及Western blot評(píng)價(jià)沉默效率，篩選出最有效的干擾序列用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。運(yùn)用CCK-8、流式細(xì)胞術(shù)、Transwell實(shí)驗(yàn)等技

4、術(shù)觀察siRNA沉默p38γ后U251細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲能力的變化。同時(shí)為研究前述變化的具體作用機(jī)制，檢測(cè)hTERT、MMP-2及MMP-9蛋白含量(western blot)，端粒酶活性（TRAP-PCR銀染法），Caspase-3/-9酶活性（分光光度法）及細(xì)胞骨架形態(tài)（免疫熒光染色）。
　　結(jié)果:
　　1.與非腫瘤性腦組織相比，星形細(xì)胞瘤中p38γ蛋白的表達(dá)明顯升高，且在高級(jí)別星形細(xì)胞瘤中表達(dá)量高于低級(jí)別星形細(xì)

5、胞瘤(P＜0.05)。hTERT蛋白的表達(dá)規(guī)律亦如此，且與p38γ蛋白的表達(dá)水平呈正相關(guān)(P＜0.01)。但p38γ表達(dá)水平與患者年齡、性別及腫瘤直徑不相關(guān)(P＞0.05)。
　　2.Real time-PCR和western blot分析顯示，三組p38γ-siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞后，p38γmRNA和蛋白表達(dá)均受到抑制(P＜0.05)。其中siRNA-3片段（針對(duì)1168位點(diǎn)）沉默效率最高，與空白及陰性干預(yù)對(duì)照組相比

6、，其p38γ mRNA抑制率達(dá)（92.7±1.12）％，p38γ蛋白表達(dá)下降達(dá)（62.2±1.29）％(P＜0.01)。
　　3.U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染p38γ/siRNA后，其細(xì)胞增殖率為（47.0±2.3）％凋亡率為（11.97±0.41）％，與空白及陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。siRNA沉默p38γ基因的U251細(xì)胞中hTERT蛋白表達(dá)受到明顯抑制，端粒酶活性顯著下降，Caspase-3/-9酶活性顯著上升，

7、與另外兩組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　4.U251細(xì)胞轉(zhuǎn)染p38γ/siRNA后，遷移穿膜細(xì)胞數(shù)為44.0±1.0，侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)為30.6±0.9，與空白及陰性對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。免疫熒光顯微鏡下可見(jiàn)，抑制p38γ表達(dá)的U251細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架明顯紊亂，稀疏，成束性結(jié)構(gòu)減少。侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)相比另外兩組均下降(P＜0.01)。
　　結(jié)論:

8、　　1.p38γ蛋白在人腦星形細(xì)胞瘤中異常高表達(dá)，且其表達(dá)水平與腫瘤惡性程度呈正相關(guān)。
　　2.U251細(xì)胞中的p38γ因siRNA干擾而下調(diào)后，可能經(jīng)由抑制hTERT表達(dá)進(jìn)而降低端粒酶活性，從而起到抑制U251細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡的作用。
　　3.U251細(xì)胞中的p38γ被siRNA沉默后，可能通過(guò)紊亂肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，下調(diào)侵襲相關(guān)蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)來(lái)降低U251細(xì)胞的遷移侵襲能力。
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