供體特異性體內(nèi)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)在新西蘭大白兔皮膚移植模型中的應(yīng)用.pdf

1、研究背景：
　　 器官移植是治療許多終末期疾病和惡性腫瘤等疾病的有效辦法，但是器官移植后必需應(yīng)用免疫抑制劑防止急性排斥反應(yīng)的發(fā)生，免疫抑制劑通過抑制T細(xì)胞和B細(xì)胞等靶細(xì)胞的細(xì)胞增殖、細(xì)胞因子合成而起作用。自環(huán)孢素和新型免疫抑制劑廣泛應(yīng)用于臨床以來，器官移植存活率已經(jīng)有了提高，但排斥反應(yīng)依然是導(dǎo)致移植器官功能不全以至丟失的重要原因，此外長期免疫抑制治療的副作用，如心血管疾病、機(jī)會(huì)感染、惡性腫瘤、藥物的肝腎毒性，也極大阻礙患者的長期

2、存活。因此，建立可靠的免疫監(jiān)測(cè)方法，不僅能夠幫助醫(yī)生根據(jù)移植受者不同的免疫應(yīng)答狀態(tài)合理地調(diào)整免疫抑制方案，而且可為臨床移植免疫耐受的誘導(dǎo)提供必要條件。但是目前仍然無法區(qū)分移植抗原引起的免疫排斥反應(yīng)和病毒細(xì)菌感染引起的免疫反應(yīng)。理想的免疫抑制治療應(yīng)該在免疫抑制和保持免疫力間取得平衡，因此對(duì)于臨床醫(yī)生來說移植患者管理是一件很困難的事。保存受體免疫力，盡可能減小免疫抑制劑用量或誘導(dǎo)免疫耐受一直是移植免疫學(xué)家的主要目標(biāo)，這方面雖然也取得了一些令

3、人興奮的成果，但是誘導(dǎo)耐受仍然有大量的工作要做，研究誘導(dǎo)免疫耐受方法，盡可能減小免疫抑制的用量，研究檢測(cè)免疫耐受及免疫力的免疫學(xué)方法將是今后幾年器官移植所面臨的最重要的挑戰(zhàn)。
　　 移植后受體的可靠的免疫狀態(tài)指標(biāo)可以為免疫抑制劑的使用提供依據(jù)，使免疫抑制劑不僅可以根據(jù)排斥反應(yīng)的程度或耐受情況使用，還可以根據(jù)患者的易感性規(guī)范化用藥，由于長期免疫抑制劑治療所引起的的高發(fā)病率和高死亡率，高度期望規(guī)范化用藥能夠?qū)崿F(xiàn)。目前，人們圍繞著免疫

4、反應(yīng)發(fā)生、發(fā)展過程中所涉及的細(xì)胞及分子，提出了一系列監(jiān)測(cè)指標(biāo)，包括:細(xì)胞介導(dǎo)的淋巴淋巴細(xì)胞毒試驗(yàn)(Cell-mediatedlymphotoxicity)，外周血中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)2、-4、-10、γ干擾素、TNF-α、sCD30等細(xì)胞因子的檢測(cè)，受體血內(nèi)的供體特異性抗體的檢測(cè)，T細(xì)胞對(duì)抗原非特異性多克隆刺激物反應(yīng)的檢測(cè)(Tcellresponsestopolyclonal，non-antigen-specif

5、icstimulation)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)的監(jiān)測(cè)，血液中細(xì)胞因子的mRNA前體分析，以及采用蛋白質(zhì)組學(xué)的方法尋找血液或者尿液或支氣管肺泡灌洗液中與移植排斥有關(guān)的生物標(biāo)記物，均從不同側(cè)面反映著機(jī)體的免疫水平以及對(duì)移植物的排斥情況，但是，由于免疫反應(yīng)的復(fù)雜性，目前的免疫學(xué)檢測(cè)方法均有其局限性，各有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，甚至有時(shí)候得出矛盾的結(jié)果，不能很好地區(qū)分出移植耐受和移植排斥反應(yīng)，因此依靠單一免疫指標(biāo)來評(píng)估機(jī)體的免疫狀態(tài)不太現(xiàn)實(shí)，臨床

6、上衡量器官移植后排斥反應(yīng)及免疫抑制治療的效能主要通過排斥反應(yīng)的發(fā)生情況（病理活檢）和移植物功能情況，如腎移植時(shí)血肌酐和尿素氮值，肝移植時(shí)肝功能情況（血氨、ALT、AST、膽紅素等）來進(jìn)行評(píng)估。但是，僅根據(jù)臨床癥狀和病理活檢還是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的，因?yàn)榕R床癥狀發(fā)生時(shí)移植物排斥已較嚴(yán)重，不適合早期診斷;而且活組織病理檢查對(duì)移植物和宿主均是一種損傷性檢查，不能反復(fù)進(jìn)行。
　　 本課題設(shè)計(jì)了一種簡單的體內(nèi)試驗(yàn)方法來監(jiān)測(cè)皮膚移植后新西蘭大白兔的免

7、疫狀態(tài)，其啟發(fā)源于淋巴細(xì)胞毒性試驗(yàn)在體內(nèi)的應(yīng)用，方法為用活細(xì)胞染料羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(Carboxyfluoresceindiacetate，succinimidylester，CFDA-SE，也簡稱為CFSE)標(biāo)記移植復(fù)合抗原供體細(xì)胞，標(biāo)記的脾細(xì)胞懸液輸注給不同的受體，輸注后不同時(shí)間點(diǎn)采血進(jìn)行流式細(xì)胞分析。流式細(xì)胞儀檢測(cè)供體淋巴細(xì)胞在受體內(nèi)遭受排斥反應(yīng)過程，同時(shí)設(shè)置同基因受體細(xì)胞作為內(nèi)參照，消除系統(tǒng)誤差，在單細(xì)胞水平判定受

8、體的免疫狀態(tài)，以期為同種異體移植受體免疫狀態(tài)的監(jiān)測(cè)提供一種簡單有效的方法。
　　 目的：
　　 建立一種能檢測(cè)皮膚移植后大白兔的免疫狀態(tài)的供體抗原特異性體內(nèi)細(xì)胞毒性試驗(yàn)方法，了解體內(nèi)細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的抗原特異性，移植排斥模型理論上具有抗原特異性，僅對(duì)供體復(fù)合抗原有特異性排斥反應(yīng)。
　　 方法：
　　 建立A組:異體皮膚移植排斥模型組;D組:低劑量免疫抑制劑異體皮膚移植排斥模型組;E組:高劑量免疫抑制劑異體皮膚

9、移植排斥模型組，分別輸將供體（雌性新西蘭大白兔）及受體（雄性新西蘭大白兔）脾臟，流式細(xì)胞檢測(cè)兩種混合細(xì)胞懸液比例變化情況，同時(shí)設(shè)置B組自體皮膚移植模型組，C組:未行皮膚移植對(duì)照組，與皮膚排斥模型組進(jìn)行對(duì)比研究。以上各組皮膚移植排斥模型建立后，從以上各組中分別取雌性新西蘭大白兔（供體）及雄性新西蘭大白兔（受體）脾臟制備脾細(xì)胞單細(xì)胞懸液，分別用不同濃度CFSE染色（雌性新西蘭大白兔用高濃度6μM，雄性新西蘭大白兔用低濃度0.24μM染色）后

10、制備1:1混合細(xì)胞懸液，混合懸液制備成功后立即注入雄性新西蘭大白兔（受體）體內(nèi)，混合懸液注射后分別于1h、2h、4h、8h抽取外周血，用紅細(xì)胞裂解液將紅細(xì)胞裂解后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)小鼠外周血兩種熒光細(xì)胞的比例變化，并計(jì)算各組雌性新西蘭大白兔（受體）脾細(xì)胞的殺傷率（按公式計(jì)算供體特異性細(xì)胞殺傷率:％specificlysis=1—donorcells/recipientcells×100％），與移植皮片狀態(tài)及常規(guī)病理檢查進(jìn)行對(duì)比研究。

11、>　　 結(jié)果：
　　 1、雌兔→雄兔異體移植排斥組:皮膚移植排斥模型在移植后第9天皮膚開始脫落，13.0±1.0天時(shí)移植排斥模型移植皮膚完全排斥，移植皮膚壞死。雄兔自體皮膚移植模型:移植皮膚未出現(xiàn)排斥現(xiàn)象，移植物可以長期存活。雌兔→雄兔異體移植低劑量免疫抑制劑組:可見移植皮膚在兩周左右逐漸變黑，出現(xiàn)壞死的跡象，皮膚存活時(shí)間為13.4±1.1天。雌兔→雄兔異體移植高劑量免疫抑制劑組:移植后14天可見移植皮膚存活，移植皮膚存活時(shí)間

12、大于25天。2、各組皮膚移植病理結(jié)果示:A組（移植排斥組）與D組（免疫抑制劑低劑量組），移植皮膚均出現(xiàn)壞死，均可見皮膚結(jié)構(gòu)破壞，大量淋巴細(xì)胞浸潤;B組（自體移植耐受組）與E組（免疫抑制劑高劑量組）皮膚均存活，未出現(xiàn)移植皮膚壞死的病理表現(xiàn)，可見皮膚結(jié)構(gòu)正常，無淋巴細(xì)胞浸潤。3、皮膚移植排斥模型組和低劑量免疫抑制劑組注射混合脾細(xì)胞懸液后殺傷率在8h達(dá)到高水平86.19±6.95％和88.14±4.21％，在8小時(shí)異基因供體雄兔脾細(xì)胞基本被完

13、全清除，而其余各組殺傷率在8小時(shí)仍處于較低的水平，自體移植耐受組8小時(shí)殺傷率為31.58±3.41％，未移植組8小時(shí)殺傷率為33.51±3.49％，異體皮膚移植高劑量免疫抑制劑組8小時(shí)殺傷率為26.82±3.26％。各時(shí)間點(diǎn)殺傷率進(jìn)行單向方差分析結(jié)果顯示:各時(shí)間點(diǎn)殺傷率進(jìn)行單向方差分析結(jié)果顯示:各時(shí)間點(diǎn)間殺傷率均有顯著差異，1小時(shí)各組殺傷率有顯著差異，F(xiàn)=226.53，P=0.000;2小時(shí)各組殺傷率有顯著差異，F(xiàn)=218.37，P=0

14、.000;4小時(shí)各組殺傷率有顯著差異，F(xiàn)=340.11，P=0.000;8小時(shí)各組殺傷率有顯著差異，F(xiàn)=240.07，P=0.000。Dunnettt(2-sided)法檢驗(yàn)，各組與A組（異體移植排斥組）兩兩比較顯示:各時(shí)間點(diǎn)A組與B組、C組、E組之間有顯著性差異，A組與D組之間無顯著性差異。即未移植組、自體移植組、高劑量免疫抑制劑組殺傷率上升緩慢，無特異性殺傷?？梢姼鹘M殺傷率與移植皮膚狀態(tài)及病理改變一致。
　　 結(jié)論：