一種文蛤多肽基因的克隆、原核表達、純化及功能性研究.pdf

1、本研究結合分子生物學、微生物學及發(fā)酵工程技術與理論，構建文蛤原肌球蛋白原核表達工程菌及使用親和層析的方法得到了目的蛋白。
　　方法：根據基因工程技術結合原肌球蛋白相關基因信息，由其基因的特點設計出兩段PCR引物，擴增基因得到目的基因，測序分析克隆結果。使用T載體快速擴增克隆目的基因，連接目的基因與表達載體。然后通過大腸桿菌誘導表達得到目的產物，使用親和層析技術純化目的蛋白。結果：文蛤原肌球蛋白多肽（MMTM）是一種抗癌多肽，分子大

2、小約為32kDa。從蛋白特性分析結果中，蛋白理論上pI值為4.5?；驕y序結果與基因文庫中文蛤原肌球蛋白序列有十幾個堿基差異，而翻譯為蛋白后目的蛋白的結果和目的基因一致，這種差異的原因可能是原核表達載體大腸桿菌的密碼子偏好性和真核生物不同。最終由IPTG誘導發(fā)酵表達目的蛋白，凝膠分析可以看到在32kDa左右有一深色條帶，使用蛋白測序分析這種蛋白即為目的產物。
　　發(fā)酵過程中發(fā)現目的產物的產量沒有達到預計要求，為了后續(xù)的藥理學實驗研

3、究所以設計了優(yōu)化培養(yǎng)以提高目的蛋白的產量。方法：單因素實驗確定幾個因素最適條件，并篩選培養(yǎng)基的主要因素，選用五種培養(yǎng)基LB、LB+M9、M9、SOB、2*TY的搖瓶發(fā)酵，再根據結果設計培養(yǎng)基優(yōu)化實驗。首先使用PB設計確定發(fā)酵的主要因素及水平，然后由 PB實驗篩選因素中的最大影響因素設計交互實驗結果得到各個因素最佳組合水平。結果：驗證了適合發(fā)酵培養(yǎng)的因素有：有機碳源如葡萄糖、酵母粉及胰蛋白胨等，氮源如氯化銨、酵母粉及胰蛋白胨，無機鹽成分等

4、。這些因素都會影響發(fā)酵的進行，但環(huán)境因素如pH及溶氧量等因素也是制約的因素，而由于條件的限制實驗未能進行。從五種培養(yǎng)基的篩選得出LB+M9混合培養(yǎng)基是大腸桿菌培養(yǎng)的合適選擇，搖瓶發(fā)酵中菌體量達到50g/L，說明充足的營養(yǎng)可以提高生物利用。PB設計結果說明葡萄糖、酵母粉及硫酸鎂是影響目的蛋白產量的主要因素，然后利用中心點實驗設計驗證這三種因素的相互作用及結果，結果顯示整模型統(tǒng)計學有效，設計符合發(fā)酵實驗要求，其中葡萄糖和酵母粉對實驗結果具有

5、交互影響，通過實驗優(yōu)化驗證目的產物得率提高了56％。
　　通過體外抑制實驗驗證了目的產物對癌細胞抑制作用。利用MTT方法評價目的蛋白的細胞活性，DAPI染色方法說明了目的蛋白對癌細胞核形態(tài)及變化的作用，從而評價藥物的作用。方法：研究通過體外細胞培養(yǎng)技術及MTT細胞抑制率實驗評價了MMTM蛋白的癌細胞抑制活性。使用DAPI染色觀察到MMTM細胞形態(tài)有顯著變化。結果：細胞抑制實驗表明 MMTM對細胞有很好的抑制作用，在高濃度情況下可以