人重組Tg檢測(cè)TgAb間接ELISA法的建立及其初步臨床應(yīng)用.pdf

1、自身免疫性甲狀腺疾病(AITD)是臨床常見(jiàn)病，由一組由于免疫系統(tǒng)自身攻擊引起的疾病組成，它包括橋本甲狀腺炎(Hashimotodisease，HT)、Graves病(Gravesdisease，GD)和特發(fā)性甲狀腺功能減退癥。人甲狀腺球蛋白(Thyroglobulin，Tg)產(chǎn)生的自身抗體(TgAb)是反映AITD患者免疫狀態(tài)的常用指標(biāo)之一。迄今為止，國(guó)內(nèi)外所用測(cè)定TgAb的方法中，Tg抗原多提取自人甲狀腺組織，來(lái)源相對(duì)受限，還難免混雜

2、其它蛋白雜質(zhì)，目前尚少有使用重組hTg為抗原建立檢測(cè)方法的相關(guān)報(bào)道。 目的：利用分子生物學(xué)技術(shù)在原核系統(tǒng)表達(dá)hTg抗原決定簇片段(1491bp)，獲得hTg抗原決定簇基因融合蛋白(簡(jiǎn)稱為重組hTg蛋白)。以該基因工程產(chǎn)品為抗原，建立檢測(cè)TgAb的間接ELISA方法，鑒定后用于臨床檢測(cè)300例正常人血清標(biāo)本，確定正常切限值，檢測(cè)5種甲狀腺疾病患者血清(共484例)，計(jì)算其TgAb水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異及其陽(yáng)性檢出率。 方法：從宿

3、主菌E.coliTOP10中提取出含有hTg抗原決定簇基因的原核表達(dá)型質(zhì)粒pET102/D-TOPO，將其轉(zhuǎn)化入表達(dá)菌E.coliBL21StarTM(DE3)，異丙基硫代半乳糖苷(isopropylβ-D-thioglactoside，IPTG)終濃度為1.0mM、25℃、6h進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，超聲波碎菌，碎菌上清經(jīng)Ni-NTAHis·Bind樹(shù)脂親和層析純化，獲得重組hTg，用SDS-PAGE、ELISA法分別檢測(cè)重組蛋白的分子量和免疫

4、活性，用考馬斯亮藍(lán)染色法定量。以純化后的重組hTg為抗原建立ELISA法，重組抗原和待測(cè)血清最佳工作濃度的確定采用交叉連續(xù)稀釋法。測(cè)定批內(nèi)變異系數(shù)(批內(nèi)cv)和批間CV。用所建立的ELISA法和臨床上常用的以提取全長(zhǎng)hTg為抗原的RIA法分別檢測(cè)30例血清標(biāo)本進(jìn)行相關(guān)性分析。測(cè)定300例健康體檢者，確立正常界限值，然后分別檢測(cè)5種甲狀腺疾病患者484例：橋本甲狀腺炎(HT)219例，Graves病212例(初診121例、復(fù)診91例)，亞

5、急性甲狀腺炎(SAT)19例，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫20例，單純性甲狀腺腫14例。所得數(shù)據(jù)用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)比較行t檢驗(yàn)及方差分析，率的比較用卡方檢驗(yàn)。 結(jié)果： 1、從宿主菌E.coliTOP10中提取出原核表達(dá)型質(zhì)粒pET102/D-TOPO，PCR鑒定目的基因無(wú)誤。重組hTg表達(dá)產(chǎn)率為3.3mg/L。分子量測(cè)定為72.68kD，與理論值70.8kD相差2.66％，ELISA法確定產(chǎn)物有免疫活性。

6、 2、當(dāng)包被抗原量1μg/孔，一抗1:50倍稀釋，堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人IgG為1:20000，顯色條件為37℃60min時(shí)，陽(yáng)性血清與陰性血清的A值差距最大，為3.291(以陽(yáng)性A405/陰性A405值>2.1為基本條件)，故選作最佳條件。用此ELISA法與RIA法比較呈正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)r=0.899，P<0.01)。陽(yáng)性與陰性質(zhì)控血清批內(nèi)CV分別是4.3％和4.7％；批間CV分別是4.7％和12.2％。 3、臨床檢測(cè)結(jié)果：(

7、1)ELISA檢測(cè)300份健康體檢者血清，TgAb值在各年齡組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.655，P>0.05)，在性別間差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.68，P>0.05)，故合并為正常對(duì)照組，A405值-x±s為0.404±0.173，陽(yáng)性切值是0.74。(2)GD初診和GD復(fù)診患者血清TgAb含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.690，P>0.05)，故合并為GD組。(3)HT組TgAb含量顯著高于GD組(t=11.171，P<0.01)、

8、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(t=14.886，P<0.01)、單純性甲狀腺腫(t=15.984，P<0.01)、SAT(t=12.936，P<0.01)和正常對(duì)照組(t=18.728，P<0.01)：GD組TgAb含量顯著高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(t=3.409，P<0.01)、單純性甲狀腺腫(t=3.606，P<0.01)和正常對(duì)照組(t=4.775，P<0.01)；SAT組hTg含量高于正常對(duì)照組(t=2.051，P<0.05)，其余組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)

9、學(xué)意義(P>0.05)。(4)HT、GD初診、GD復(fù)診、SAT、結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、單純性甲狀腺腫患者的陽(yáng)性檢出率分別為70.8％、38.8％、28.6％、5.3％、5.0％、0。合組后的GD組陽(yáng)性檢出率為34.4％。其中，HT組陽(yáng)性檢出率分別顯著高于其他5組(P<0.01)。GD初診組除稍高于GD復(fù)診組(P>0.05)外，分別明顯高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫(P<0.01)、單純性甲狀腺腫(P<0.05)或SAT組(P<0.01)。GD復(fù)診組分別明