人Fc-ApoH的ELISA法的建立及初步應(yīng)用.pdf

1、【研究目的】
　　原發(fā)性肝癌（PLC）是全球死亡率最高的惡性腫瘤之一，其死亡率居全球惡性腫瘤的第三位。早期診斷是顯著提高肝癌治療的有效手段。目前，我國常用的肝癌診斷標(biāo)志物是血清AFP和AFP-L3。由于臨床上40％左右肝癌患者AFP水平并不升高，使AFP和AFP-L3的應(yīng)用大大受限。因此，我們迫切需要尋找其他標(biāo)志物用于肝癌的早期診斷。AFP-L3是指發(fā)生高度巖藻糖基化的AFP，可以與小扁豆凝集素（LCA）特異性結(jié)合，又稱AFP異質(zhì)

2、體。早期研究表明，人血清中存在許多糖蛋白也發(fā)生類似的巖藻糖基化，這類分子有可能成為肝癌診斷的候選標(biāo)志物。
　　本課題組在先期研究尋獲的一批在肝癌患者血清中與非肝癌患者相比表達(dá)量存在明顯差異的巖藻糖基化糖蛋白的基礎(chǔ)上，擬建立一種基于小扁豆凝集素親和的ELISA方法直接檢測巖藻糖基化糖蛋白，為我們的后期課題奠定基礎(chǔ)。同時我們選擇其中的Fc-ApoH作為測定的靶蛋白，以觀察隨著肝癌發(fā)生、發(fā)展的過程，其表達(dá)水平是否逐步降低，并進(jìn)一步探討F

3、c-ApoH作為肝癌診斷新的標(biāo)志物的可能性，試圖為肝癌早期診斷提供一種新的檢測方法。
　　【研究方法】
　　1.收集不同患者血清標(biāo)本，并分為3組：肝癌組（80例）、良性肝病組（57例）和健康人組（52例）共189例。
　　2.采用載脂蛋白H的抗體作為包被抗體，辣根過氧化物酶標(biāo)記的小扁豆凝集素作為檢測物，建立基于小扁豆凝集素的血清ELISA法檢測人Fc-ApoH，優(yōu)化該方法反應(yīng)條件，并分析該方法的相關(guān)性能。
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4、.采用該方法檢測患者血清中Fc-ApoH的水平，計(jì)算其臨界值，分析其診斷肝癌的敏感性和特異性，并與AFP診斷水平進(jìn)行比較。
　　【研究結(jié)果】
　　1.本ELISA反應(yīng)條件摸索情況如下：1：800稀釋包被抗體，1：200稀釋酶標(biāo)小扁豆凝集素，是最適的配伍濃度；最適包被條件是4℃過夜；最適的封閉液是1%BSA的PBST；最適封閉條件是37℃60 min；包被抗體與血清的最適反應(yīng)條件是37℃60 min；酶標(biāo)小扁豆凝集素和待測血清

5、的最適反應(yīng)條件室溫下30 min；最適底物反應(yīng)條件是37℃條件下避光反應(yīng)15 min。
　　2.本ELISA法檢測人Fc-ApoH的大致線性范圍78.1ng/ml-1250ng/ml；最低檢測限60.02 ng/ml；正常人參考下限為348.1μg/ml。批內(nèi)、批間變異均小于10%。
　　3.肝癌組血清Fc-ApoH水平（μg/ml）與慢性肝病組、健康人組相比顯著降低（P＜0.001）。通過受試者工作特征曲線設(shè)定327.5μ

6、g/ml作為Fc-ApoH診斷肝癌的臨界點(diǎn)時，其診斷肝癌的敏感性和特異性分別為77.5%和84.4%，ROC曲線下面積為0.887。
　　4.在本研究肝癌組80名患者血清標(biāo)本中，血清Fc-ApoH檢測肝癌的敏感性（77.5%）明顯高于血清AFP檢測（62.5%）。
　　【結(jié)論】
　　1.初步建立了基于小扁豆凝集素親和的檢測人血清Fc-ApoH的ELISA方法，為研究Fc-ApoH在肝癌血清中的表達(dá)水平提供了有效的工具，