人玻璃體中AQP4的ELISA方法建立及在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的初步應(yīng)用.pdf

1、背景隨著人們生活水平的提高以及一些綜合因素的作用，糖尿病的發(fā)病率也逐漸上升，并趨向年輕化，與此同時(shí)其并發(fā)癥的發(fā)病率也逐年升高。作為糖尿病患者最常見和最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，糖尿病性視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR)隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，如果發(fā)展到視網(wǎng)膜病變的后期即增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變期，將會(huì)對(duì)視力造成不可逆轉(zhuǎn)的損害。糖尿病性視網(wǎng)膜病變已嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量，但目前其發(fā)病機(jī)制并不完全明確，糖尿病性視網(wǎng)膜病變的主

2、要病理改變是由于高血糖引起視網(wǎng)膜毛細(xì)血管滲漏造成視網(wǎng)膜水腫，繼而引起視網(wǎng)膜組織缺血缺氧，最終引發(fā)新生血管的生成。目前糖尿病性視網(wǎng)膜病變中研究較多的是視網(wǎng)膜，研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜水腫、缺血和缺氧等條件均會(huì)引起視網(wǎng)膜內(nèi)水通道蛋白4（aquaporin4，AQP4）表達(dá)水平的改變，而近年的研究發(fā)現(xiàn)糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者血清中水通道蛋白的水平也發(fā)生改變，但玻璃體內(nèi)水通道蛋白4的表達(dá)水平如何目前尚不明確。
　　目的：建立檢測(cè)糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者

3、玻璃體內(nèi)水通道蛋白4抗原及抗體的酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法，并用本試驗(yàn)建立的方法分析糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者玻璃體內(nèi)AQP4表達(dá)水平的變化。
　　方法：本研究以兔抗人水通道蛋白4抗體為包被抗體，羊抗兔IgG-HRP為酶標(biāo)抗體，分別建立檢測(cè)人眼玻璃體內(nèi)水通道蛋白4抗原抗體的ELISA檢測(cè)方法；并對(duì)兩種方法的工作條件進(jìn)行優(yōu)化，包括抗體的工作濃度，封閉溫度和時(shí)間，孵育溫度和時(shí)間，顯色溫度和時(shí)間等。隨后對(duì)兩種方法的線性、檢測(cè)范圍、最低檢測(cè)限以及重復(fù)性

4、等性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。最后用這兩種方法分別測(cè)定正常人和糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者玻璃體內(nèi)水通道蛋白4抗原抗體的水平，統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析正常人和糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者玻璃體內(nèi)水通道蛋白4抗原抗體表達(dá)水平的差異。
　　結(jié)果：初步建立了檢測(cè)人眼玻璃體內(nèi)水通道蛋白4抗原的雙抗體夾心ELISA方法和檢測(cè)水通道蛋白4抗體的競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法。雙抗體夾心ELIS A的工作條件：最佳包被抗體濃度為2.0μg/ml；最佳封閉溫度和時(shí)間為37℃封閉1h，夾心一抗最

5、佳工作濃度為1:800，最佳孵育溫度和時(shí)間為37℃1 h，酶標(biāo)抗體最適濃度為1:3500，最佳顯色條件為時(shí)間為37℃顯色15 min。標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0178 x+0.1937，決定系數(shù)R2=0.9938，線性范圍為3.125-100ng/ml，最低檢測(cè)限為3.125 ng/ml，3次批內(nèi)CV％分別為3.80%、4.68%、4.18%，批間CV%為3.01%。競(jìng)爭(zhēng)法ELISA工作條件：包被抗體和酶標(biāo)抗體的最適濃度分別為1:500和1:5

6、000，最佳封閉溫度和時(shí)間為37℃封閉1 h，夾心一抗的最佳稀釋度為1:400，實(shí)際工作濃度是1:800，最佳孵育條件為37℃孵育1 h，最佳顯色條件為37℃顯色15 min。標(biāo)準(zhǔn)曲線y=-0.3937 lgX+1.4471，決定系數(shù)R2=0.9893，線性范圍為2.5-80ng/ml，最低檢測(cè)限為2.5 ng/ml，三批試驗(yàn)測(cè)得的批內(nèi)CV%分別為2.41%，2.60%，1.60%，批間CV%為2.49%。兩種ELIS A方法的批內(nèi)變異

7、系數(shù)均小于5%，批間CV%小于10%。正常人與糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者玻璃體內(nèi)水通道蛋白4抗原水平比較有顯著性差異（P＜0.05），而兩組間的抗體水平比較也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.初步建立了檢測(cè)人眼玻璃體內(nèi)AQP4抗原的雙抗體夾心ELISA檢測(cè)方法。
　　2.初步建立了檢測(cè)人眼玻璃體內(nèi)AQP4抗體的競(jìng)爭(zhēng)法ELISA檢測(cè)方法。
　　3.糖尿病性視網(wǎng)膜病變患者玻璃體內(nèi)AQP4抗原及抗體的表達(dá)