勞森氏胞內(nèi)菌的PCR檢測方法及其抗體間接ELISA檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、豬增生性腸炎(porcine proliferative enteritis，PE)是由勞森氏胞內(nèi)菌（lawsoniaintracellularis，LI）引起的一種傳染性腸道疾病，主要感染回腸，影響豬生長發(fā)育、飼料轉(zhuǎn)化率等。勞森氏胞內(nèi)菌是一種彎曲或直的弧狀桿菌，末端漸細(xì)或鈍圓，長1.25-1.75μm，寬0.25-0.43μm。此菌是一種典型的具有三層外膜的革蘭氏陰性菌，沒有發(fā)現(xiàn)纖毛和孢子。嚴(yán)格胞內(nèi)寄生，因其特殊的培養(yǎng)條件，目前世界上

2、分離到的菌株十分有限。目前國內(nèi)對其臨床感染情況的相關(guān)研究報道還很少，因此有必要對其進行進一步研究?，F(xiàn)將本文研究內(nèi)容簡述如下:
　　 1.勞森氏菌16SrDNA的PCR方法的建立與應(yīng)用2011年3月至2012年4月，從江蘇規(guī)?；i場采集糞便100份，建立勞森氏胞內(nèi)菌套式PCR方法進行鑒定。檢測結(jié)果顯示勞森氏胞內(nèi)菌陽性12份，陽性率為12％，其中育肥豬陽性6份（20份）、保育豬陽性5份（20份）、后備豬陽性1份（20份）、妊娠豬和哺

3、乳豬均為陰性，育肥豬、保育豬的陽性率分別為30％、25％，說明該病原主要感染發(fā)育階段的豬，影響豬日增重及飼料轉(zhuǎn)化率，從而可造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，應(yīng)當(dāng)引起足夠重視。
　　 2.勞森氏胞內(nèi)菌外膜蛋白基因在大腸桿菌的高效表達及表達產(chǎn)物的純化制備參考GenBank上已發(fā)表的勞森氏胞內(nèi)菌外膜蛋白基因序列，設(shè)計引物進行擴增，并將該片段定向插入到原核表達載體pET-32a(+)中成功構(gòu)建出原核表達載體，將其轉(zhuǎn)化宿主菌BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，S

4、DS-PAGE電泳分析初步確定重組的融合蛋白pET32α-1102能夠進行表達35KDa的條帶，表達產(chǎn)物經(jīng)His-tag柱子純化后進行Western blotting分析，初步確定融合蛋白pET32α-1102具有抗原性。研究結(jié)果驗證勞森氏胞內(nèi)菌外膜蛋白基因表達的蛋白具有抗原性，為診斷試劑盒及基因工程疫苗的研制提供了理論基礎(chǔ)。
　　 3.豬勞森氏菌抗體間接ELISA方法的建立與應(yīng)用以表達的外膜蛋白作為診斷抗原包被酶標(biāo)板，建立了可

5、檢測勞森氏菌抗體的間接ELISA方法。經(jīng)優(yōu)化條件，最佳包被濃度為20 ng/mL，血清的最佳稀釋倍數(shù)為1∶400，最佳反應(yīng)時間為30分鐘，酶標(biāo)二抗的最佳工作稀釋度為1∶15000，最佳作用時間為30分鐘。92份豬血清樣品分別用建立的間接ELISA和進口試劑盒進行平行檢測，結(jié)果顯示建立的間接ELISA方法與進口試劑盒的符合率達97.82％，其中陽性符合率為95.12％，陰性符合率為96.22％。血清學(xué)試驗結(jié)果證實豬對勞森氏胞內(nèi)菌產(chǎn)生的血清