安徽地區(qū)PEDVS基因序列分析及間接ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種高度接觸性腸道傳染病。該病在1971年首次報(bào)道于英國(guó)，1976年我國(guó)也證實(shí)了本病。目前，PED已經(jīng)成為影響全球養(yǎng)豬業(yè)最為嚴(yán)重的病毒性傳染病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。近幾年，我國(guó)PED的發(fā)病率、死亡率均呈上升趨勢(shì)，尤其是自2010年10月以來(lái)，PED在我

2、國(guó)的流行廣泛并呈現(xiàn)新的特點(diǎn)。感染PEDV后，哺乳仔豬死亡率達(dá)80％?100%，而繁殖母豬和公豬則很少表現(xiàn)出臨床癥狀。病毒的變異可能是引起PED大規(guī)模爆發(fā)的原因，這給本病的防治帶來(lái)了新的挑戰(zhàn)。因此對(duì)于PEDV基因遺傳進(jìn)化的分析以及建立一種快速、可靠的PEDV抗體檢測(cè)方法，進(jìn)行PED流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)以及豬群免疫過(guò)PED疫苗后抗體水平的檢測(cè)，對(duì)于本病的預(yù)防具有重要意義。本研究?jī)?nèi)容包括以下部分:
　　1：安徽地區(qū)PEDV S基因遺傳進(jìn)化分析

3、
　　為分析2014?2015年安徽地區(qū)豬流行性病毒（PEDV）的變異情況，本研究設(shè)計(jì)合成3對(duì)特異性引物，對(duì)2014?2015年采集自安徽省12個(gè)地級(jí)市21個(gè)不同地區(qū)發(fā)生腹瀉的豬場(chǎng)，經(jīng)檢測(cè)為PEDV陽(yáng)性的病料，對(duì)這21株P(guān)EDV毒株的S基因全基因序列測(cè)序，并對(duì)其進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，21株P(guān)EDV安徽地區(qū)毒株除AHBB-1外，20株P(guān)EDV安徽地區(qū)毒株S基因全長(zhǎng)均為4161bp。21株P(guān)EDV S基因核苷酸和氨基酸的同源性分

4、別為96.3%?99.9%和96.0%?99.8%；與經(jīng)典CV777株核苷酸和氨基酸同源性分別為93.7%?95.9%和92.6%?96.8%。21株安徽毒株除AHBB-1株外，其他20株S基因均存在相同的插入和缺失,這些位點(diǎn)核苷酸的插入和缺失導(dǎo)致了其編碼的氨基酸相應(yīng)改變。S基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，21株安徽毒株除 AHBB-1外20株處于同一分支，且與2011?2012年的6株中國(guó)其它地區(qū)毒株、2014年的2株中國(guó)其他地區(qū)毒株、2

5、005?2009年3株韓國(guó)毒株親緣關(guān)系均較密切，而與歐洲株（CV777、Brl）、中國(guó)現(xiàn)用疫苗株(CV777-vaccine)及中國(guó)早期分離株CH/S親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。S蛋白抗原位點(diǎn)分析表明，安徽分離株與現(xiàn)用疫苗株（CV777-vaccine）相比，流行毒株S蛋白的主要抗原位點(diǎn)及COE區(qū)域均發(fā)生了變異。
　　2.間接ELISA檢測(cè)方法的建立
　　利用生物學(xué)軟件分析PEDV S蛋白抗原位點(diǎn)，選擇編碼親水性較強(qiáng)、抗原指數(shù)較高且表面

6、可及性好的區(qū)域，針對(duì)這個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，以PEDV基因組反轉(zhuǎn)錄后cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收、純化后克隆至原核表達(dá)載體pET-32a（+）中，構(gòu)建原核表達(dá)重組載體pET-32a-S，經(jīng)重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，以SDS-PAGE蛋白電泳鑒定是否表達(dá)及表達(dá)形式；以Western-blot鑒定重組蛋白的免疫活性。摸索重組S蛋白的最佳表達(dá)條件，對(duì)重組蛋白S進(jìn)行純化，用純化后的S蛋白作為包被物，建立PEDV抗體

7、間接ELISA檢測(cè)方法，并與進(jìn)口商品化PEDV抗體試劑盒和Western-blot金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，比較二者的符合率、敏感性和特異性。結(jié)果表明：本研究成功擴(kuò)增出所需S基因片段并構(gòu)建重組載體pET-32a-S，誘導(dǎo)表達(dá)出重組S蛋白，經(jīng)Western-blot分析驗(yàn)證具有良好的反應(yīng)原性。通過(guò)對(duì)建立間接ELISA檢測(cè)方法的優(yōu)化，最終確定反應(yīng)的最佳蛋白包被濃度為8mg/L，封閉液為2%BSA，一抗的最佳稀釋度為1:40，最佳作用時(shí)間為30mi

8、n，羊抗豬IgG-HRP最佳稀釋度1:1500稀釋?zhuān)罴炎饔脮r(shí)間為45min，顯色時(shí)間為10min。重復(fù)試驗(yàn)表明組內(nèi)及組間變異系數(shù)均小于10%，重復(fù)性較好。與進(jìn)口商品化 PEDV抗體檢測(cè)試劑盒相比符合率、敏感性和特異性為86.67%、89.83%、82.62%；與western-blot檢測(cè)結(jié)果相比，符合率、敏感性和特異性88.89%、90.20%、83.33%。結(jié)果表明：以表達(dá)的重組S蛋白為包被抗原建立的間接ELISA檢測(cè)方法特異性高