規(guī)?；膛ｐB(yǎng)殖場(chǎng)布魯氏菌病血清學(xué)調(diào)查與間接ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、近年來(lái)，我國(guó)奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展勢(shì)頭迅猛，奶牛養(yǎng)殖正朝向規(guī)模化和集約化方向發(fā)展，奶牛布魯氏菌病引發(fā)的流產(chǎn)等各種問(wèn)題在規(guī)?；翀?chǎng)中日益嚴(yán)重。缺乏奶牛布魯氏菌病的流行病學(xué)數(shù)據(jù)是我國(guó)控制牛布魯氏菌病的重要障礙之一。布魯氏菌第一組外膜蛋白o(hù)mp10、omp16和omp19被證明為良好的免疫原性，是亞單位疫苗的熱門候選，是重要的毒力蛋白;本實(shí)驗(yàn)擬利用實(shí)驗(yàn)室保存的第一組外膜蛋白作為診斷抗原，建立一種針對(duì)牛血清布魯氏菌抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。

2、　　自2011年1月-2013年6月，實(shí)驗(yàn)室收到送檢和采集的全國(guó)范圍內(nèi)的規(guī)模化奶牛養(yǎng)殖場(chǎng)血樣樣本進(jìn)行虎紅平板凝集實(shí)驗(yàn)，對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)大群和流產(chǎn)奶牛進(jìn)行初步的篩查。將實(shí)驗(yàn)室保存的質(zhì)粒pEASY-T3-omp10、pEASY-T3-omp16和pEASY-T3-omp19經(jīng)克隆、酶切、鑒定，重新連接pET-32a(+)表達(dá)載體，通過(guò)大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)重組蛋白pET-32a-omp10、pET-32a-omp16和pET-32a-omp19，

3、經(jīng)SDS-PAGE及Western-blot分析鑒定后，采用Ni-NTA Spin Kit純化重組蛋白，分別利用純化獲得的重組蛋白進(jìn)行包被，嘗試構(gòu)建幾種間接ELISA檢測(cè)方法，成功建立的方法進(jìn)行臨床血清的檢測(cè)（實(shí)驗(yàn)室保存的251份臨床血清），檢測(cè)結(jié)果與RBPT進(jìn)行對(duì)比，判斷建成方法的特異性、敏感性和準(zhǔn)確性。
　　虎紅檢測(cè)奶牛血清樣本共計(jì)5575份，陽(yáng)性血清1036份，占檢測(cè)樣本總數(shù)的18.58％。其中，群檢奶牛血清樣本4980份，

4、陽(yáng)性樣本792份，虎紅陽(yáng)性率為15.90％;流產(chǎn)奶牛血清樣本595份，陽(yáng)性樣本244份，虎紅陽(yáng)性率為41.01％。成功表達(dá)純化重組蛋白o(hù)mp10、omp16和omp19，以omp16為包被抗原建立的iELISA檢測(cè)方法具有穩(wěn)定性好、靈敏度高的特點(diǎn)，與虎紅平板凝集試驗(yàn)的符合率可達(dá)86.57％;而omp10和omp19在方法建立的過(guò)程中出現(xiàn)陽(yáng)性血清不同梯度OD值差異不大，陰性血清OD值與梯度無(wú)關(guān)的情況，陰陽(yáng)性血清的OD450值的商值(P/N

5、)差異很小（小于1），無(wú)論如何改變抗原和血清稀釋度，這一情況都沒(méi)有得到改善，故omp10和omp19未能成功構(gòu)建檢測(cè)方法。
　　全國(guó)范圍內(nèi)，布魯氏菌病的發(fā)病情況比較嚴(yán)重，而且范圍很廣，呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，布魯氏菌病引起的奶牛流產(chǎn)，在各種流產(chǎn)因素中占據(jù)很大比例。成功構(gòu)建的omp16 iELISA方法穩(wěn)定、可靠，可作為奶牛布魯氏菌病血清學(xué)候選方法，同時(shí)為omp16免疫原性和抗感染保護(hù)作用的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ);omp10和omp19不適合作