LMoV CP原核表達(dá)、抗血清制備及葉綠體中的檢測(cè).pdf

1、碩士學(xué)位論文LMoVCP原核表達(dá)、抗血清制備及葉綠體中的檢測(cè)ProkaryoticExpression，AntiserumPreparationandDetectioninChloroplastsofLMoVCP作者姓名：學(xué)科、專業(yè)：學(xué)號(hào)：指導(dǎo)教師：完成日期：大連理工大學(xué)DalianUniversityofTechnology大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要百合斑駁病毒(三ilymottlevirus，LMoV)屬于馬鈴薯Y病毒屬(Poty

2、vll“14S)，是侵染百合的主要病毒之一。LMoV侵染百合后引起斑駁或條紋癥狀，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致百合種球產(chǎn)量和質(zhì)量降低。目前，關(guān)于LMoV的致病機(jī)理尚不清楚，其編碼蛋白功能的研究也尚屬空白，嚴(yán)重阻礙了百合病毒病的防治工作。本文建立了檢測(cè)LMoV的血清學(xué)方法，并初步證明了LMoV對(duì)百合葉綠體的影響，以期為闡明LMoV的致病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。根據(jù)GenBank中LMoV基因序列(玎屺225211)，設(shè)計(jì)特異性引物，利用RTPCR技術(shù)，以提取的百合葉

3、片總RNA為模板，擴(kuò)增到LMoVCP基因，獲得了約822bp的目的片段。將目的片段連接到克隆載體p／VIDTMl8T中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMDTMl8C尸，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5a中，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證正確后測(cè)序，結(jié)果表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMDTMl8一CP。以pMDTMl8CP為模板，PCR擴(kuò)增得到LMoVCP基因。利用pET28a()作為表達(dá)載體，成功構(gòu)建了重組表達(dá)質(zhì)粒pET28aCP，將其轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(D

4、E3)qb，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)過(guò)SDSPAGE分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pET28aCP成功在大腸桿菌中表達(dá)出相對(duì)分子質(zhì)量約為34kDa的帶有His標(biāo)簽的融合蛋白。對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的溫度和時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，確定了融合蛋白的最佳表達(dá)條件是30℃條件下誘導(dǎo)4h。利用NiIDASefmose在變性條件下對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到表達(dá)量較高的單一目的蛋白條帶。以表達(dá)的融合蛋白為抗原制備LMoV的抗血清，利用間接ELISA和Westernblot分別對(duì)制備的抗血清進(jìn)

5、行了檢測(cè)，其效價(jià)為1：51200，且特異性較高。隨機(jī)選取7個(gè)百合樣品同時(shí)進(jìn)行間接ELISA和RTPCR檢測(cè)，兩次檢測(cè)結(jié)果一致，由此證明，本研究中制備的LMoVCP抗血清可用于百合樣品的檢測(cè)。電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：感病百合葉綠體膨脹變形，基質(zhì)片層散亂，葉綠體內(nèi)淀粉粒腫大，從而證明LMoV侵染破壞葉綠體結(jié)構(gòu)。免疫金標(biāo)記電鏡觀察顯示，與LMoVCP抗原特異性結(jié)合的膠體金顆粒主要定位于類囊體膜上。SDSPAGE和Westernblot證明LMoV侵染百