奶牛金黃色葡萄球菌黏附素基因的原核表達(dá)及其與牛白介素18的真核共表達(dá)和抗血清活性分析.pdf

1、奶牛乳腺炎是乳腺組織因病原微生物的感染而引起的炎癥，可導(dǎo)致奶牛生產(chǎn)性能低下，奶的產(chǎn)量和品質(zhì)下降。嚴(yán)重者可造成患病乳區(qū)泌乳功能永久性喪失。在引發(fā)奶牛乳腺炎的病原菌中金黃色葡萄球菌的作用尤為突出，在某些地區(qū)大約50％以上的乳腺炎是由該菌引發(fā)。自發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌表面的黏附蛋白與其致病力密切相關(guān)后，黏附蛋白的相關(guān)研究一直是國內(nèi)外研究的熱點。同時鑒于白細(xì)胞介素18(Interleukin-18，IL-18)具有多種生物學(xué)活性，在免疫調(diào)節(jié)、抗感染

2、及慢性炎癥性疾病發(fā)病過程中起著重要作用。所以我們針對金葡菌黏附素和牛白介素18展開了研究。 試驗1金黃色葡萄球菌ClfA功能基因的克隆表達(dá) 采用PCR方法對金黃色葡萄球菌山東分離株ZFB1的聚集因子A(ClfA)基因進(jìn)行擴增，并將其克隆到原核表達(dá)載體pGEX-6p-1中獲得重組克隆pGEX/ClfA，使ClfA與GST進(jìn)行融合表達(dá)。在SDS-PAGE和Western blot試驗中，表達(dá)產(chǎn)物分子量(約67KDa)同預(yù)期結(jié)

3、果相符，與兔源抗ZFB1全價血清有特異的抗體結(jié)合活性。本研究表明：金葡菌ZFB1的ClfA基因與已發(fā)表的NEWMAN株(NCBI ACCESSION NUMBER：AP009351)序列在核苷酸水平的同源性均為99.9％，氨基酸水平的同源性為100％，兩者的差異僅是由于在41位發(fā)生T變?yōu)镃的無義突變；在大腸桿菌中ClfA蛋白表達(dá)量可達(dá)菌體總蛋白的24.2％，從而為奶牛金黃色葡萄球菌性乳腺炎的防治提供了科學(xué)的實驗依據(jù)。 試驗2金黃

4、色葡萄球菌聚集因子ClfA蛋白抗血清活性分析 按照實驗1中最佳誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)ClfA蛋白表達(dá)，而后進(jìn)行SDS-PAGE，將其凍干并碾成粉末。用PBS與碾碎的粉末等體積混合后，取0.2ml(約20μg抗原)，腹腔和背部皮下注射健康的五周齡小鼠，每隔兩周加強免疫共五次，末次免疫后第10天斷尾采血制備血清，而后采用黏附與黏附抑制試驗?zāi)M金黃色葡萄球菌定植奶牛乳腺組織的致病過程，以ClfA/GST抗血清的黏附抑制率表示其活性。結(jié)果顯示：2

5、％、1％、0.5％和0.2％的陽性血清其抑制率分別為65％、60％、46％和41％，與陰性血清相比差異極顯著(P<0.001)。隨著血清濃度的下降黏附抑制作用也減弱，當(dāng)陽性血清濃度為0.1％時，黏附抑制作用則很不明顯，僅為3％，與陰性血清相比差異不顯著(P=0.35)。本研究結(jié)果證實ClfA可以作為保護(hù)性抗原基因，為研制有效的金黃色葡萄球菌性乳腺炎疫苗奠定了基礎(chǔ)。 試驗3金黃色葡萄球菌ClfA功能基因的克隆表達(dá)與牛IL-18基因

6、真核共表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá) 本研究旨在構(gòu)建金黃色葡萄球菌聚集因子A基因和牛IL-18基因共表達(dá)的真核載體，并對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定檢測。參照聚集因子A(ClfA)和牛白介素18(BoIL-18)cDNA序列分別設(shè)計引物進(jìn)行擴增，將ClfA基因和BoIL-18基因分別插入到真核雙表達(dá)載體pBUDCE4.1的CMV和EF-1α兩個啟動子的下游，構(gòu)建攜帶兩個目的基因的重組真核雙表達(dá)載體pBUDCE/ClfA/BoIL-18。在Cellf

7、ectin Reagent的作用下轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，用間接免疫熒光試驗檢測ClfA和BoIL-18蛋白，結(jié)果證明重組質(zhì)粒pBUDCE/ClfA/BoIL-18在293T細(xì)胞中同時表達(dá)了ClfA和BoIL-18蛋白。 該重組載體的成功構(gòu)建為研究ClfA和BoIL-18重組共表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性及其防治奶牛金黃色葡萄球菌性乳腺炎的作用奠定基礎(chǔ)。 試驗4金黃色葡萄球菌FnbpA功能基因的克隆表達(dá)與牛IL-18基因真核共表達(dá)載體

8、的構(gòu)建與表達(dá) 本研究旨在構(gòu)建金黃色葡萄球菌FnbpA基因和牛IL-18基因共表達(dá)的真核載體，并對其表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定檢測。參照FnbpA和牛白介素18(BoIL-18)cDNA序列分別設(shè)計引物進(jìn)行擴增，將FnbpA基因和BoIL-18基因分別插入到真核雙表達(dá)載體pBUDCE4.1的CMV和EF-1α兩個啟動子的下游，構(gòu)建攜帶兩個目的基因的重組真核雙表達(dá)載體pBUDCE/FnbpA/BoIL-18。在Cellfectin Reage