牛乳中致病性金黃色葡萄球菌nEBPS基因的克隆與原核表達(dá)產(chǎn)物抗原性研究.pdf

1、目的構(gòu)建牛乳源性金黃色葡萄球菌彈性纖維結(jié)合蛋白N端蛋白(N-terminalelastinbindingproteinsofS.aureus，nEBPS)原核表達(dá)系統(tǒng)，并對其表達(dá)蛋白進(jìn)行抗原性研究。
　　方法提取金黃色葡萄球菌臨床分離菌株的基因組總DNA，參考GenBank公布的金黃色葡萄球菌nEBPS基因序列，利用DNAStar生物信息學(xué)軟件中Protean功能預(yù)測nEBPS基因的抗原表位、親水性和抗原性指數(shù)等參數(shù)，應(yīng)用Prim

2、er5.0和Oligo6.0生物信息學(xué)軟件設(shè)計克隆引物，經(jīng)PCR克隆nEBPS基因序列，將其克隆至pET-30(a)表達(dá)質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)(MCS)，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒nEBPS-pET-30(a)，將nEBPS-pET-30(a)轉(zhuǎn)入E.coli/BL21(DE3)中構(gòu)建重組工程菌，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，通過SDS-PAGE電泳分析表達(dá)蛋白圖譜。再用Western-blot驗(yàn)證免疫反應(yīng)原性;利用Ni2+親和層析純化重組的蛋白，并建立檢測免疫

3、抗體的間接ELISA方法，對金黃色葡萄球菌nEBPS表達(dá)蛋白免疫家兔血清抗體滴度進(jìn)行檢測;制備金黃色葡萄球菌原生質(zhì)體，利用間接熒光抗體技術(shù)對其細(xì)胞膜表面nEBPS蛋白進(jìn)行定位檢測。
　　結(jié)果經(jīng)測序和酶切鑒定表明，成功克隆了金黃色葡萄球菌nEBPS基因序列，成功構(gòu)建原核表達(dá)系統(tǒng)并進(jìn)行高效表達(dá)，表達(dá)蛋白的相對分子質(zhì)量為34KD，蛋白表達(dá)量占菌體總量的42.6％，可溶性表達(dá)量達(dá)到46.5％，純化蛋白含量達(dá)到2.08mg/mL。Weste

4、rn-blot結(jié)果表明，重組蛋白有良好的反應(yīng)原性。間接ELISA檢測3免后第58d的家兔血清抗體，其滴度達(dá)到1∶5100，免疫70d后抗體滴度仍能達(dá)到1∶4500。經(jīng)制備金黃色葡萄球菌原生質(zhì)體細(xì)胞，利用間接熒光抗體技術(shù)檢測膜表面nEBPS蛋白，結(jié)果表明該蛋白為膜表面蛋白。
　　結(jié)論成功克隆了牛乳中金黃色葡萄球菌nEBPS基因序列，該序列的長度為720bp，編碼240個氨基酸殘基，構(gòu)建的重組表達(dá)系統(tǒng)獲得高效可溶性表達(dá);建立了檢測金黃