牛乳中致病性金黃色葡萄球菌nEBPS基因的克隆與原核表達產物抗原性研究.pdf

1、目的構建牛乳源性金黃色葡萄球菌彈性纖維結合蛋白N端蛋白(N-terminalelastinbindingproteinsofS.aureus，nEBPS)原核表達系統(tǒng)，并對其表達蛋白進行抗原性研究。
　　方法提取金黃色葡萄球菌臨床分離菌株的基因組總DNA，參考GenBank公布的金黃色葡萄球菌nEBPS基因序列，利用DNAStar生物信息學軟件中Protean功能預測nEBPS基因的抗原表位、親水性和抗原性指數等參數，應用Prim

2、er5.0和Oligo6.0生物信息學軟件設計克隆引物，經PCR克隆nEBPS基因序列，將其克隆至pET-30(a)表達質粒的多克隆位點(MCS)，構建重組表達質粒nEBPS-pET-30(a)，將nEBPS-pET-30(a)轉入E.coli/BL21(DE3)中構建重組工程菌，用IPTG誘導表達，通過SDS-PAGE電泳分析表達蛋白圖譜。再用Western-blot驗證免疫反應原性;利用Ni2+親和層析純化重組的蛋白，并建立檢測免疫

3、抗體的間接ELISA方法，對金黃色葡萄球菌nEBPS表達蛋白免疫家兔血清抗體滴度進行檢測;制備金黃色葡萄球菌原生質體，利用間接熒光抗體技術對其細胞膜表面nEBPS蛋白進行定位檢測。
　　結果經測序和酶切鑒定表明，成功克隆了金黃色葡萄球菌nEBPS基因序列，成功構建原核表達系統(tǒng)并進行高效表達，表達蛋白的相對分子質量為34KD，蛋白表達量占菌體總量的42.6％，可溶性表達量達到46.5％，純化蛋白含量達到2.08mg/mL。Weste

4、rn-blot結果表明，重組蛋白有良好的反應原性。間接ELISA檢測3免后第58d的家兔血清抗體，其滴度達到1∶5100，免疫70d后抗體滴度仍能達到1∶4500。經制備金黃色葡萄球菌原生質體細胞，利用間接熒光抗體技術檢測膜表面nEBPS蛋白，結果表明該蛋白為膜表面蛋白。
　　結論成功克隆了牛乳中金黃色葡萄球菌nEBPS基因序列，該序列的長度為720bp，編碼240個氨基酸殘基，構建的重組表達系統(tǒng)獲得高效可溶性表達;建立了檢測金黃