人血清白蛋白融合人粒細胞集落刺激因子融合蛋白的克隆表達.pdf

1、目的：構(gòu)建重組人血清白蛋白粒細胞集落刺激因子(pPIC9K-HSA-hG-CSF)表達載體,用電轉(zhuǎn)化方法將線性化重組表達載體質(zhì)粒pPIC9K-HSA-hG-CSF轉(zhuǎn)化整合入畢赤酵母宿主菌SMD1168中,甲醇誘導(dǎo)表達出具有生物活性的融合蛋白,對轉(zhuǎn)化子進行Western-blot檢測,用小鼠骨髓白血病細胞(NFS-60)細胞檢測其生物學(xué)活性。
　　方法：PCR擴增出人血清白蛋白基因(HSA)和粒細胞集落刺激因子基因(hG-CSF),

2、GGGGS作為小肽接頭,采用重疊PCR的方法將HSA和hG-CSF拼接起來,與質(zhì)粒載體pPIC9K連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH-5α。抽提質(zhì)粒,用SalI酶切重組質(zhì)粒,電轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入畢赤酵母SMD1168中,通過表型篩選和誘導(dǎo)表達實驗得到蛋白表達工程菌。將陽性轉(zhuǎn)化子進行PCR鑒定和Mut表型鑒定并用甲醇誘導(dǎo)表達,將表達上清進行Western-Blot鑒定，NFS-60細胞測活實驗測定其體外生物學(xué)活性。在搖瓶培養(yǎng)條件下,初步研究了甲醇誘

3、導(dǎo)濃度及菌體誘導(dǎo)起始OD600值兩因素對轉(zhuǎn)化子表達水平的影響。
　　結(jié)果：通過PCR擴增技術(shù)成功獲得HSA-hG-CSF基因,經(jīng)測序驗證結(jié)果正確。通過電轉(zhuǎn)化方法成功將酶切線性化重組表達質(zhì)粒DNA整合入宿主菌基因組,并在甲醇誘導(dǎo)下成功表達出融合蛋白。在搖瓶培養(yǎng)試驗條件下,通過對甲醇誘導(dǎo)濃度及誘導(dǎo)起始OD600值兩因素對轉(zhuǎn)化子表達水平的影響發(fā)現(xiàn):在0.5％～4.0％的范圍,隨著甲醇誘導(dǎo)濃度的升高蛋白表達量也升高,在其他因素固定時,菌體

4、誘導(dǎo)起始OD600值在5～60的范圍內(nèi),隨著OD600值的升高表達量下降。Western-blot分析表明融合蛋白具有粒細胞集落刺激因子免疫原性。NFS-60細胞測活實驗分析表明體外活性達到約4.0×107IU/mg。
　　結(jié)論：成功制備了pPIC9K-HSA-hG-CSF表達載體,該表達載體攜帶的HSA-hG-CSF可以在畢赤酵母SMD1168表達出目的融合蛋白;表達的融合蛋白經(jīng)過免疫學(xué)分析和測活試驗表明通過本次研究成功表達出長