暫態(tài)表達重組蛋白雞輸卵管生物反應器的優(yōu)化.pdf

1、隨著重組DNA技術的飛速發(fā)展，已經(jīng)出現(xiàn)了多種生產(chǎn)重組蛋白的表達系統(tǒng)，其中以轉基因動物生物反應器，尤其是轉基因哺乳動物的乳腺生物反應器和轉基因家禽的輸卵管生物反應器的優(yōu)點最為突出，能在不損傷機體正常生理功能的條件下源源不斷地獲得表達產(chǎn)品。家禽具有繁殖周期短、生產(chǎn)性能高、研究成本較低等優(yōu)點，其輸卵管是生產(chǎn)蛋白質的天然“發(fā)酵罐”，更加適合作為生產(chǎn)重組蛋白的生物反應器。但由于家禽特殊的生殖生理特點，其轉基因技術一直落后于其它動物。雖然近幾年來相

2、關技術有所突破，但家禽轉基因研究仍有許多理論和技術難題有待突破，距離產(chǎn)業(yè)化開發(fā)仍有很遠的路要走。為此，尋求禽類的轉基因技術的突破和開辟新的研究方法已成為當前研究工作的重點。 本課題組用自行克隆的雞卵清蛋白(OV)基因表達調控序列構建成雞輸卵管定位表達載體，以人溶菌酶和組織激肽釋放酶(hK1)基因為目的基因的雞輸卵管暫態(tài)表達試驗結果表明，通過翅靜脈注射一定劑量的重組載體后，能表達一定水平的重組酶并分泌到試驗雞的蛋清中，具有一定的開

3、發(fā)利用價值。本研究在前期研究的基礎上，以hK1基因為目的基因，通過對先前構建的雞輸卵管特異表達載體進行優(yōu)化改造，旨在獲得結構更為合理、表達水平更高、維持時間更長的表達載體。在先前構建的pOV3K載體的基礎上，分別通過酶切消化或PCR擴增等方法，將其中3.0kb的OV基因5'-調控序列的長度分步縮減，獲得三個新的重組載體分別命名為pOV4K、pOV5K和pOV6K。將此重組載體與25kDa聚乙烯亞胺(polyethylenimine，PE

4、I)混合，經(jīng)翅靜脈注射產(chǎn)蛋雞，用標準方法檢測蛋清中的重組酶活性，結果表明，含1.1kbOV基因5'-調控序列的pOV6K表達水平和表達時間均不如含3.0kbOV基因5'-調控序列的pOV3K，含2.1kbOV基因5'-調控序列的pOV4K和含1.7kbOV基因5'-調控序列的pOV5K與含3.0kbOV基因5'-調控序列的pOV3K表達水平相當，說明1.7kbOV基因5'-調控序列足以指導外源基因的表達。為了進一步增強外源基因的表達水平

5、，將由pOV5K中的1.7kbOV基因5'-調控序列、hK1cDNA及牛生長激素基因終止信號(BGHpA)組成的表達盒，插入到含禽腺聯(lián)病毒(AAAV)ITR和Rep蛋白基因的載體中，旨在獲得穩(wěn)定表達載體，獲得新的重組表達載體命名為pITRLRepOV5K。用上述方法將PEI包被的重組載體注射產(chǎn)蛋雞，蛋清中的重組酶活性檢測結果表明，在注射相同拷貝數(shù)重組載體的條件下，重組載體pITRLRepOV5K的表達量及維持時間均優(yōu)于pOV5K，不僅獲

6、得了結構更為合理、表達水平更高、維持時間更長的雞輸卵管特異表達載體，而且為以AAAV為基因轉移載體制備轉基因雞輸卵管生物反應器打下了基礎。 鑒于以pITRLRepOV5K載體建立的雞輸卵管暫態(tài)表達技術的潛在應用價值，有必要對其進一步研究。將2mgpITRLRepOV5K載體與PEI混合后注射產(chǎn)蛋雞，對注射蛋雞組織進行重組酶活性檢測，結果顯示外源基因表達僅限于雞的輸卵管組織，提示重組載體表達具有較好的組織特異性；在初次載體注射后檢