輸卵管與輸卵管內(nèi)膜干細胞的分離培養(yǎng)與鑒定.pdf

1、本文內(nèi)容分為兩部分進行了論述：
　　第一部分輸卵管間充質(zhì)干細胞分離培養(yǎng)與鑒定
　　目的：
　　輸卵管組織為臨床婦產(chǎn)科手術(shù)后常見廢棄組織，本實驗旨在通過細胞形態(tài)，細胞表面標志物分析及體外誘導分化實驗證明輸卵管組織中存在間充質(zhì)干細胞(MSCs)，并通過體外誘導分化實驗證明輸卵管干細胞的多向分化潛能。
　　方法：
　　1、收取2013年6月至9月就診于北京海軍總醫(yī)院手術(shù)治療的6例患者的輸卵管組織，6例患者因子宮肌

2、瘤、子宮內(nèi)膜癌、子宮頸癌及卵巢癌等疾病行輸卵管組織切除術(shù)。
　　2、利用體外胰酶消化法將輸卵管組織進行消化，然后行細胞培養(yǎng)及細胞傳代。
　　3、將P3代細胞行流式細胞學鑒定，鑒定所用抗體為:CD13-FITC，CD29-APC，CD44-APC，CD90-FITC，CD14-APC，CD19-APC，CD34-PE,CD45-FITC，CD73-PE，CD105-PercP，CD166-PE，HLA-DR-APC,HLA-A

3、BC-FITC。
　　4、取P3代輸卵管細胞在體外通過誘導分化培養(yǎng)基而向骨、脂肪及軟骨方向進行誘導分化，并將誘導分化后的細胞行RT-PCR鑒定。成脂分化引物:PPAR-γ2和AP2;成骨分化引物:Osteocalcin、Osteopontin和ALP;成軟骨分化引物:Sox-9和COMP。
　　結(jié)果：
　　1、本實驗中輸卵管中培養(yǎng)出來的細胞符合2006年美國國際細胞治療協(xié)會所提出的關(guān)于間充質(zhì)干細胞的鑒定標準，所以本實驗

4、證明了輸卵管組織分離培養(yǎng)出來的細胞為間充質(zhì)干細胞。
　　2、輸卵管間充質(zhì)干細胞在體外具有向骨、脂肪及軟骨多向分化的潛能。
　　結(jié)論：
　　輸卵管組織是婦產(chǎn)科手術(shù)后常見的臨床廢棄組織，根據(jù)2006年美國國際細胞治療協(xié)會提出的間充質(zhì)干細胞的鑒定標準:1.細胞為貼壁細胞。2.流式細胞結(jié)果必須≥95％的MSCs表達CD105、CD90和CD73，同時必須滿足≤2％的MSCs表達CD34、CD45、CD14、CD11b、CD79

5、α、CD19和HLA-Ⅱ。3.細胞在體外具有向骨、脂肪及軟骨分化的能力。本實驗中輸卵管細胞在培養(yǎng)48小時后貼壁，經(jīng)流式細胞分析結(jié)果顯示:輸卵管細胞均陽性表達CD73、CD105和CD90，同時輸卵管細胞在體外具備向成骨、軟骨及脂肪分化能力。所以，輸卵管組織中存在間充質(zhì)干細胞，也間接說明了輸卵管組織是間充質(zhì)干細胞的又一新來源，體外誘導分化實驗也證明了輸卵管間充質(zhì)干細胞具有向骨、脂肪與軟骨分化的潛能，可以為輸卵管間充質(zhì)干細胞治療相關(guān)方面的疾

6、病提供依據(jù)。
　　第二部分輸卵管與輸卵管內(nèi)膜干細胞的比較研究
　　目的：
　　體外分離培養(yǎng)及鑒定輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞。并從細胞形態(tài)、表型、增殖分化及體外因子分泌等方面將輸卵管與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞進行比較研究，并從生物學特性和治療潛能角度來評估他們對于組織損傷修復的潛能。
　　方法：
　　1、取同一患者的輸卵管組織（左側(cè)）和輸卵管內(nèi)膜組織（右側(cè)），患者年齡為35-55歲之間，6例患者因子宮肌瘤、子宮內(nèi)膜

7、癌、子宮頸癌及卵巢癌等疾病行輸卵管組織切除術(shù)。
　　2、將輸卵管與輸卵管內(nèi)膜組織在體外用胰酶+膠原酶Ⅰ消化法將組織消化成細胞，然后行細胞培養(yǎng)及細胞傳代。
　　3、取P3代輸卵管與輸卵管內(nèi)膜細胞進行流式細胞學分析來鑒定細胞表面分子標志物，所用抗體:CD13-FITC，CD29-APC，CD44-PE，CD90-FITC，CD14-APC，CD19-APC，CD34-PE，CD45-FITC，CD73-PE，CD105-Perc

8、P,CD166-PE，HLA-DR-APC，HLA-ABC-FITC。
　　4、用克隆形成率與CCK-8兩種方法來比較P3代輸卵管與輸卵管內(nèi)膜細胞的增殖能力。
　　5、體外誘導分化實驗:將P3代輸卵管與輸卵管內(nèi)膜細胞在體外經(jīng)誘導分化培養(yǎng)基培養(yǎng)后向骨、脂肪及軟骨方向誘導分化。
　　6、將輸卵管與輸卵管內(nèi)膜細胞誘導分化為骨、脂肪及軟骨后，通過RT-PCR方法比較兩者誘導分化后與骨、脂肪及軟骨相關(guān)基因表達水平，從而比較兩者的

9、誘導分化潛能。
　　7、采用ELISA方法來檢測P3代輸卵管與輸卵管內(nèi)膜細胞生長及免疫因子分泌水平，并將兩者的因子分泌水平進行比較。
　　8、統(tǒng)計學處理:本實驗所有檢測樣品均為一式三份。計量資料用平均數(shù)±標準差表示，兩獨立樣本間比較采用兩獨立樣本t檢驗，實時RT-PCR數(shù)據(jù)結(jié)果采用2008版本的REST(Relative Expression Software Tool2008)進行相對定量基因表達分析，按α=0.05檢驗水

10、平，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　1、根據(jù)2006年美國國際細胞治療協(xié)會提出的關(guān)于間充質(zhì)干細胞鑒定相關(guān)標準，本實驗從輸卵管內(nèi)膜獲取細胞符合此項鑒定標準。
　　2、流式細胞學結(jié)果:輸卵管與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞均陽性表達間充質(zhì)干細胞相關(guān)表面分子標志物(CD90，CD73，CD105)以及細胞粘附分子(CD166，HLA-ABC)，均陰性表達造血干細胞血表面標志物(CD34，CD45，CD14，HLA-

11、DR，CD19)。與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞相比較，輸卵管間充質(zhì)干細CD44及CD13的表達顯著增強。
　　3、克隆形成率:與輸卵管間充質(zhì)干細胞相比較，輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞形成克隆團數(shù)量較多，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　4、根據(jù)CCK-8結(jié)果繪制出的生長曲線圖提示:1、P3代輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞對數(shù)生長期倍增時間短于輸卵管間充質(zhì)干細胞差異具有統(tǒng)計學意義。
　　2、輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞增殖能力強于輸卵管間充質(zhì)干細胞。<

12、br>　　5、體外誘導分化實驗結(jié)果提示:P3代輸卵管與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞都具有在體外向骨、脂肪及軟骨分化的潛能。
　　6、RT-PCR結(jié)果提示:與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞相比較，輸卵管間充質(zhì)干細胞經(jīng)成骨誘導分化后，Osteocalcin、Osteoponlin及ALP三種骨相關(guān)基因表達水平均高于輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞。輸卵管與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞經(jīng)成脂及成軟骨誘導分化后，兩者脂肪及軟骨相關(guān)基因表達水平無明顯差別。
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13、、體外因子分泌結(jié)果提示:輸卵管與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞在體外均分泌一定量的生長因子及免疫因子，生長因子包括:bFGF、EGF、GM-CSF、HGF及VEGF。免疫因子包括:IL-4、IL-6、TNF-α、TNF-β及IFN-γ。生長因子檢測結(jié)果:輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞分泌的bFGF、EGF及GM-CSF水平高于輸卵管間充質(zhì)干細胞，但輸卵管間充質(zhì)干細胞分泌HGF與VEGF水平較高。免疫因子檢測結(jié)果:輸卵管內(nèi)膜干細胞相對分泌較高水平免疫因子

14、IL-4，TNF-α和TNF-β。但是輸卵管間充質(zhì)干細胞相對分泌較高水平的IFN-γ。IL-6分泌水平在兩者之間并沒有明顯差距。IL-2與IL-10均因濃度太低未能檢測。
　　結(jié)論：
　　1、本實驗證實輸卵管內(nèi)膜中存在間充質(zhì)干細胞。我們將其命名為輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞。
　　2、與輸卵管間充質(zhì)干細胞相比較，輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)出較強的增殖能力及較短的倍增時間，增殖能力是評估干細胞治療潛能的重要指標，提示輸卵管內(nèi)膜

15、間充質(zhì)干細胞具有更大的治療前景。
　　3、經(jīng)體外誘導及RT-PCR實驗結(jié)果提示:輸卵管間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)出極強的成骨能力，與輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞相比較，輸卵管間充質(zhì)干細胞在治療骨相關(guān)疾病可能表現(xiàn)出較強優(yōu)勢。
　　4、輸卵管內(nèi)膜干細胞分泌較高水平的bFGF，EGF及GM-CSF，bFGF和EGF均參與上皮損傷后修復過程，在上皮修復過程中起著至關(guān)重要的作用。并且bFGF和EGF均可以加速傷口愈合減少疤痕形成。
　　5、與輸

16、卵管間充質(zhì)干細胞相比較，輸卵管內(nèi)膜干細胞分泌更較高水平的抗炎癥因子IL-4、GM-CSF及較低水平的促炎因子IFN-γ，說明輸卵管內(nèi)膜干細胞具有抗炎癥反應(yīng)作用，因此在慢性炎癥損傷中，輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞可以加速愈合速度，快速度過慢性炎癥期。
　　6、與輸卵管間充質(zhì)干細胞相比較，輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞表現(xiàn)出較強的增殖能力及因子分泌水平。經(jīng)體外基礎(chǔ)實驗研究可以認為對于組織損傷修復，與輸卵管間充質(zhì)干細胞相比較，輸卵管內(nèi)膜間充質(zhì)干細胞更