siRNA沉默Trop2基因表達對胃癌BGC823細胞遷移侵襲能力的影響.pdf

1、目的:構(gòu)建在哺乳動物細胞中表達Trop2的重組質(zhì)粒并作用于胃癌BGC823細胞株,探討重組質(zhì)粒對BGC823細胞株Trop2 mRNA及蛋白的抑制作用,以及對胃癌BGC823細胞遷移侵襲能力的影響。
　　 方法:根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的Trop2基因核苷酸序列設(shè)計三條多聚核苷酸序列,構(gòu)建三條干擾重組質(zhì)粒pGenesill.1-Trop21、pGenesill.1-Trop22、pGenesill.1-Trop23；在脂質(zhì)體

2、的介導下瞬時轉(zhuǎn)染入人胃癌BGC823細胞株,優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,熒光倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率；用實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,QRT-PCR)和Western blot分析Trop2 mRNA及蛋白的表達；Transwell小室實驗測定干擾重組質(zhì)粒對BGC823細胞株的的遷移侵襲能力的影響。
　　 結(jié)果:(1)酶切鑒定和DNA測序分析顯示,Trop2靶向RNA干擾重

3、組質(zhì)粒構(gòu)建成功。(2)細胞轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化及轉(zhuǎn)染效率的觀察:當所構(gòu)建重組質(zhì)粒與脂質(zhì)體的質(zhì)量體積比為1:4轉(zhuǎn)染時,轉(zhuǎn)染效率最高達75％。(3)QRT-PCR及Western blot的結(jié)果:干擾重組質(zhì)粒均能使胃癌BGC823細胞株中Trop2 mRNA及蛋白的表達下調(diào)。pGenesil1.1-Trop21組、pGenesil1.1-Trop22組、pGenesil1.1-Trop23組對Trop2 mRNA抑制率分別為23.9％、23.7％

4、、29.9％,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；Trop2蛋白抑制率達分別為32.8％、25.5％、62.0％,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。篩選得到pGenesil1.1-Trop23作為最佳干擾效果質(zhì)粒進行后續(xù)實驗。(4)遷移侵襲實驗結(jié)果:體外遷移實驗示pGenesil1.1-Trop23作用BGC823細胞株48小時后,穿過Matrigel膜的細胞個數(shù)為(43±6)個,與對照組比較差別有統(tǒng)計學意義(P<

5、0.05)。體外侵襲實驗pGenesil1.1-Trop23作用BGC823胞株48小時后,穿過Matrigel膜的細胞個數(shù)為(23±5)個,與對照組比較差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
　　 結(jié)論:干擾重組質(zhì)粒pGenesil1.1-Trop21、pGenesil1.1-Trop22、pGenesil1.1-Trop23均能有效抑制人胃癌BGC823細胞株Trop2 mRNA和蛋白的表達,最佳干擾質(zhì)粒pGenesil1.1-