調(diào)控胃癌BGC823細(xì)胞PTEN和Livin基因表達(dá)的生物學(xué)效應(yīng)實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、胃癌的發(fā)病率在惡性腫瘤中位居第四位，僅次于肺癌、乳腺癌和腸癌，是嚴(yán)重威脅我國(guó)人民生命健康的主要疾病之一，其發(fā)病機(jī)制迄今為止仍不明確。胃癌在發(fā)病早期癥狀不典型，部分患者就診時(shí)已進(jìn)入進(jìn)展期。盡管在手術(shù)、化療、放療等方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)步，但是進(jìn)展期胃癌患者術(shù)后5年生存率仍無(wú)明顯提高。
　　 大量研究表明，胃癌在發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有多種因素的參與，包括抑癌基因失活、癌基因突變、DNA損傷修復(fù)功能的降低、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和凋亡過(guò)程的異常等，提示胃

2、癌的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多因素、多階段、多步驟的過(guò)程。
　　 第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensinhomolokw deleted on chromosome ten，PTEN)是具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，可以負(fù)調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號(hào)通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，具有抑制細(xì)胞增殖和遷移以及促進(jìn)凋亡的效應(yīng)。PTEN基因的突變、缺失以及甲基化可以導(dǎo)致其抑癌功能喪失，引起腫瘤的發(fā)生。研究顯

3、示，胃癌組織中PTEN基因表達(dá)顯著降低，并且PTEN蛋白表達(dá)水平與腫瘤大小、Borrmann分型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期呈負(fù)相關(guān)，表明PTEN基因失活可能是胃癌發(fā)生、發(fā)展的原因之一。
　　 Livin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis proteins，IAP)家族新成員之一，它可以和半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(Caspase)直接結(jié)合而抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。研究發(fā)現(xiàn)Livin蛋

4、白在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，沉默腫瘤細(xì)胞中Livin基因可以促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤增殖。表明Livin的高表達(dá)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)。
　　 本課題采用分子生物學(xué)技術(shù)，分別建立過(guò)表達(dá)PTEN基因、沉默Livin基因表達(dá)以及過(guò)表達(dá)PTEN同時(shí)沉默Livin基因表達(dá)的胃癌細(xì)胞株；通過(guò)在體和離體實(shí)驗(yàn)，觀察調(diào)控PTEN和Livin基因表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡和遷移等方面的影響，為胃癌的治療提供新的靶點(diǎn)和策略。

5、課題共分三部分：第一部分，PTEN基因表達(dá)載體、Livin基因siRNA載體的構(gòu)建和鑒定；第二部分，體外調(diào)控PTEN、Livin基因表達(dá)對(duì)胃癌BGC823細(xì)胞生物學(xué)行為的影響；第三部分，調(diào)控PTEN/Livin基因表達(dá)對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響。
　　 第一部分、PTEN基因表達(dá)載體、Livin基因siRNA載體的構(gòu)建和鑒定
　　 方法：設(shè)計(jì)帶有EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)的PTEN基因全編碼區(qū)cDNA擴(kuò)增引物；PCR擴(kuò)增p

6、CMV6-PTEN得到PTEN基因；擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)EcoRI和SalI酶切后與表達(dá)載體pCL-neo重組；用EcoRI和salI雙酶切鑒定轉(zhuǎn)化重組子，并對(duì)重組子插入序列進(jìn)行DNA序列分析，得到PTEN基因表達(dá)載體pCL-neo-PTEN。設(shè)計(jì)3個(gè)針對(duì)Livin基因的siRNA靶序列，合成發(fā)卡樣DNA單鏈；退火成雙鏈后與siRNA載體pRNAT-U6.1重組；用PCR擴(kuò)增篩選轉(zhuǎn)化重組子，DNA序列測(cè)定鑒定插入序列，得到3個(gè)針對(duì)Livin基因的

7、siRNA載體。分別用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000包裹轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞，G418篩選得到對(duì)應(yīng)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。采用熒光定量RT-PCR和Western-Blot分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染的BGC823細(xì)胞Livin和PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.PCR擴(kuò)增得到1212bp的PTEN cDNA ORF區(qū)段目的基因；轉(zhuǎn)化后得到多個(gè)重組子，經(jīng)EcoRI/SalI雙酶切和DNA測(cè)序鑒定證實(shí)獲得的

8、重組子pCL-neo-PTEN正確。
　　 2.RNAi Explorer和siDESIGN Center掃描人Livin cDNA編碼序列(NM_139317)，初步篩選得到50個(gè)侯選片段，經(jīng)BLAST同源性分析，選擇確定3個(gè)19個(gè)堿基的siRNA靶序列，分別為178-196位(GACCTAAAGACAGTGCCAA)、539-557位(GAGGTGCTTCTTCTGCTAT)、648-666(GGAAGAGACTTTGTCC

9、ACA)。
　　 3.雙鏈發(fā)卡樣DNA si178、si539和si648與pRNAT-U6.1重組后，都得到多個(gè)重組子，PCR擴(kuò)增篩選鑒定和DNA測(cè)序分析證實(shí)得到的陽(yáng)性重組子pRNAT-U6.1-si178、pRNAT-U6.1-si539、pRNAT-U6.1-si648與設(shè)計(jì)完全一致。
　　 4.過(guò)表達(dá)PTEN組(轉(zhuǎn)染pCL-neo-PTEN)、沉默Livin1組(轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-si178)、沉默Liv

10、in2組(轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-si539)、沉默Livin3組(轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-si648)、空載體1組(轉(zhuǎn)染pCL-neo)和空載體2組(轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1)細(xì)胞經(jīng)G418篩選3w，均得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
　　 5.與空白對(duì)照相比，空載體1組和空載體2組的Livin mRNA和蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，差異無(wú)顯著性(P>0.05)；與3個(gè)對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)PTEN組、沉默Livin1組、沉默Livin2組和

11、沉默Livin3組細(xì)胞Livin mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，差異有顯著性(P<0.05)，其中沉默Livin2組的相對(duì)表達(dá)量最低。
　　 6.過(guò)表達(dá)PTEN組細(xì)胞的PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著高于其它各組(P<0.01)。
　　 第二部分體、外調(diào)控PTEN基因和Livin基因表達(dá)對(duì)胃癌BGC823細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　 方法：切下沉默Livin效果最佳siRNA載體中的Livin siRNA單

12、元，重組入PTEN基因表達(dá)載體pCL-neo-PTEN，得到表達(dá)PTEN基因、同時(shí)沉默Livin基因的調(diào)控載體pCL-neo-PTEN-siLivin，用LipofectamineTM2000包裹，然后將其轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞，G418篩選得到過(guò)表達(dá)PTEN同時(shí)沉默Livin基因的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞。與第一部分獲得的單一過(guò)表達(dá)PTEN的胃癌BGC823細(xì)胞株、單一沉默Livin表達(dá)的胃癌BGC823細(xì)胞株一起作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用RT-PCR和W

13、estern-blot測(cè)定各組細(xì)胞Livin和PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平、MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞法檢測(cè)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡、EILSA檢測(cè)Caspase-3和Caspase-9蛋白酶活性、Transwell方法檢測(cè)細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。
　　 結(jié)果：
　　 1.EcoRI酶切鑒定重組子，得到2個(gè)條帶(3.4Kb和3.8Kb)，證實(shí)Livin siRNA單元成功插入；DNA序列測(cè)定確認(rèn)得到陽(yáng)性重組子。
　　

14、 2.經(jīng)G418篩選得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCL-neo-PTEN-siLivin的胃癌BGC823細(xì)胞株。
　　 3.與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，調(diào)控組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCL-neo-PTEN-siLivin的BGC823細(xì)胞)、沉默Livin組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pRNAT-U6.1-siLivin的BGC823細(xì)胞)和過(guò)表達(dá)PTEN組(穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pCL-neo-PTEN的BGC823細(xì)胞)的LivinmRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.0

15、5)，其中調(diào)控組Livin mRNA和蛋白表達(dá)水平最低。
　　 4.與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，過(guò)表達(dá)PTEN組和調(diào)控組細(xì)胞PTENmRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有顯著性(P<0.01)。而過(guò)表達(dá)PTEN組和調(diào)控組細(xì)胞PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P>0.05)，說(shuō)明在PTEN表達(dá)載體pCL-neo-PTEN中插入Livin siRNA單元不影響PTEN表達(dá)的水平。
　　 5.在3d、4d和5d

16、 MTT檢測(cè)細(xì)胞，與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，調(diào)控組細(xì)胞OD值顯著降低，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 6.與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，調(diào)控組、沉默Livin組和過(guò)表達(dá)PTEN組細(xì)胞的Caspase-3和Caspase-9活性顯著升高，差異有顯著性(P<0.05)，其中以調(diào)控組的提高更為顯著。
　　 7.與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，調(diào)控組、沉默Livin組和過(guò)表達(dá)PTEN組的細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.

17、05)。與沉默Livin組和過(guò)表達(dá)PTEN組比較，調(diào)控組細(xì)胞凋亡率明顯升高，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 8.與空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組比較，調(diào)控組、沉默Livin組和過(guò)表達(dá)PTEN組穿透Matrigel的平均細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。與沉默Livin組和過(guò)表達(dá)PTEN組比較，調(diào)控組穿透Matrigel的平均細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異有顯著性(P<0.05)。
　　 第三部分、調(diào)控PTEN/Livin的基因表達(dá)對(duì)

18、裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的影響
　　 方法：取調(diào)控PTEN/Livin基因表達(dá)的胃癌BGC823細(xì)胞、過(guò)表達(dá)PTEN的胃癌BGC823細(xì)胞、沉默Livin表達(dá)的胃癌BGC823細(xì)胞、空載體對(duì)照的胃癌BGC823細(xì)胞和胃癌BGC823細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×108/ml，在裸鼠右側(cè)腋部皮下接種0.1ml。在注射接種后的第7d開(kāi)始測(cè)定繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線，第28天測(cè)量腫瘤大小后處死裸鼠，取腫瘤組織稱重。熒光定量RT-PCR和Western-blo

19、t檢測(cè)PTEN和Livin mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.裸鼠皮下細(xì)胞接種7d后均出現(xiàn)可見(jiàn)腫瘤塊形成：調(diào)控組、過(guò)表達(dá)PTEN組和沉默Livin組移植瘤生長(zhǎng)速度明顯慢于空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組(P<0.05)。
　　 2.調(diào)控組移植瘤平均瘤重215.42±35.15mg、過(guò)表達(dá)PTEN組移植瘤平均瘤重461.73±58.17mg、沉默Livin組移植瘤平均瘤重368.23±53.72mg，均顯著

20、低于空白對(duì)照組和空載體對(duì)照組移植瘤平均瘤重(1051.29±175.95mg和968.88±194.39mg)，差異有顯著性(P<0.05)，其中以調(diào)控組移植瘤平均瘤重最小。
　　 3.與空白對(duì)照組、空載體組和沉默Livin組比較，調(diào)控組、過(guò)表達(dá)PTEN組的PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，差異有顯著性(P<0.01)。與空白對(duì)照組、空載體組比較，調(diào)控組、沉默Livin組、過(guò)表達(dá)PTEN組的Livin mRNA和蛋白表達(dá)

21、水平顯著降低，差異有顯著性(P<0.05)，其中以調(diào)控組最低。
　　 結(jié)論：
　　 1.篩選得到過(guò)表達(dá)PTEN的胃癌BGC823細(xì)胞株、沉默Livin表達(dá)的胃癌BGC823細(xì)胞株和過(guò)表達(dá)PTEN同時(shí)又沉默Livin表達(dá)的胃癌BGC823細(xì)胞株。
　　 2.建立一種表達(dá)一個(gè)基因同時(shí)又沉默另一個(gè)基因的載體構(gòu)建方法。
　　 3.過(guò)表達(dá)PTEN同時(shí)沉默Livin的調(diào)控可以有效抑制胃癌BGC823細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖、侵