細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1-2與誘騙受體3在胃癌BGC823細(xì)胞中相關(guān)性研究.pdf

1、胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤。諸多文獻(xiàn)中均有報道：ERK/MAPK信號傳導(dǎo)途徑能夠促進(jìn)胃腸道腫瘤細(xì)胞的增殖，異?；罨軌?qū)е录?xì)胞喪失凋亡和分化的能力，促使細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化。腫瘤細(xì)胞可通過異常表達(dá)Fas或使Fas功能失常而逃逸FasL誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；同時，腫瘤細(xì)胞大量表達(dá)DcR3來競爭結(jié)合FasL逃避機體的免疫監(jiān)視。腫瘤的快速增殖、喪失凋亡、ERK的異?；罨?、DcR3的大量表達(dá)，四者之間在時間上具有一致性。前期研究通過檢測胃癌患者腫瘤標(biāo)

2、本、裸鼠模型的胃癌組織及各器官中DcR3與ERK1/2表達(dá)情況，得出以下結(jié)論：DcR3與ERK1/2在胃癌患者腫瘤標(biāo)本及裸鼠模型器官組織中的表達(dá)量增高，并有一定的協(xié)同表達(dá)。并且DcR3與ERK1/2的表達(dá)情況與胃癌的分期及轉(zhuǎn)移情況密切相關(guān)，晚期胃癌二者表達(dá)更為顯著，兩種信號因子與胃癌的發(fā)生發(fā)展可能有著密切聯(lián)系。為了更進(jìn)一步闡明兩者關(guān)系，本實驗以胃癌BGC823細(xì)胞為研究對象，通過構(gòu)建ERK1/2shRNA真核表達(dá)載體，應(yīng)用特異性抑制劑U

3、0126、PD98059、APDC抑制通路中相關(guān)分子的表達(dá)，體外研究其對人胃癌細(xì)胞株BGC823ERK1/2蛋白及DcR3分泌及FasL活性的影響。
　　 合成針對人胃癌細(xì)胞株BGC823 ERK1/2基因的RNA干擾靶序列，將其連接于PRNAT-U6.1/Neo載體，構(gòu)建ERK1/2基因shRNA重組質(zhì)粒，經(jīng)脂質(zhì)體法導(dǎo)入BGC823細(xì)胞中，干擾ERK1/2的表達(dá)。應(yīng)用特異性抑制劑U0126、PD98059、APDC抑制通路中相

4、關(guān)分子的表達(dá)。Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后BGC823細(xì)胞及抑制劑使用后ERK1/2蛋白的表達(dá)變化，熒光顯微鏡檢測質(zhì)粒自帶GFP基因的表達(dá)情況確認(rèn)轉(zhuǎn)染效率，ELISA法檢測各組細(xì)胞上清中DcR3分泌蛋白的表達(dá)特點。并利用本室制備的FasL，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測ERK信號通路的變化對FasL作用的影響。收集各組細(xì)胞上清檢測DcR3分泌水平，ELISA結(jié)果顯示：DcR3表達(dá)在各干擾組中有不同程度下降；應(yīng)用特異性抑制劑改變BGC823細(xì)

5、胞ERK通路中相關(guān)分子表達(dá)從而抑制ERK1/2的表達(dá)，Western-blot結(jié)果證實特異性抑制劑能有效抑制ERK1/2表達(dá)，收集各組細(xì)胞上清檢測DcR3分泌水平，ELISA結(jié)果顯示：DcR3表達(dá)在各組中有不同程度下降；應(yīng)用FasL作用于ERK1/2表達(dá)改變組，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：BGC823細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡率明顯上升，F(xiàn)asL活性提高。
　　 構(gòu)建成功的PRNAT-U6.1/Neo-ERK1/2干擾質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)染293T細(xì)