ZEB2基因3＇非翻譯區(qū)對胃癌EMT過程及GES-1細胞生長影響的體外研究.pdf

1、目的：
　　胃癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，位居我國惡性腫瘤死亡率的前列。目前，盡管胃癌的手術和其他治療方法都有很大的提高，預后卻不令人滿意。從分子水平來全面理解胃癌發(fā)生進展的機理，并在此基礎上尋求有效的防治方法依然是當前胃癌研究的重點和難點。
　　上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)在惡性腫瘤侵襲轉移中的作用已受到很大的關注。上皮-間質轉化指上皮細胞失去極性，轉化為成

2、纖維細胞形態(tài)，與周圍細胞的接觸減少，細胞黏附力下降，遷移和運動能力增加。此過程中，上皮細胞標志物如E-鈣粘蛋白(E-cadherin)等表達下調，間葉表型標記物如波形蛋白(vimentin)等表達上調。明確EMT在胃癌發(fā)生發(fā)展中可能的作用及機制，為胃癌的分子干預及臨床治療提供新的途徑和方法。
　　近年來，大量研究顯示非編碼RNA在多種生物學過程中具有重要的調控作用。微RNA（microRNA，miRNA）是非編碼RNA家族中被研究

3、得最多的成員，是長約22 nt的短鏈非編碼RNA，可與目標RNA部分互補結合，與miRNA結合的序列稱為miRNA反應元件(MREs)，結合后能夠通過促進靶mRNA的降解和（或）抑制其翻譯而負性調控基因的表達。人們對miRNA-mRNA的作用已有足夠的認識，但關于mRNA-miRNA反向作用卻知之甚少。一些非編碼轉錄包括基因非翻譯區(qū)(untranslated regions，UTRs)作為競爭性RNA通過競爭miRNA池調控腫瘤的發(fā)生發(fā)

4、展，但其作用機制及影響目前尚不明確。
　　方法：本課題分兩部分進行:
　　第一部分:
　　以ZEB2為研究對象，脂質體Lipofectamine2000分別將人工合成的ZEB23'UTR質粒及其siRNA轉染入人胃腺癌細胞SGC7901，實時定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)檢測轉染后miR-200a/b/c的表達， Transwell侵襲實驗和劃痕實驗檢測細胞侵襲遷移能力，蛋白印跡（Western blo

5、t）方法檢測轉染后ZEB2及EMT相關指標E-cadherin、Vimentin蛋白的表達水平。
　　第二部分:
　　將人工合成的ZEB23'UTR質粒及miR-200b micmics采用脂質體Lipofectamine2000轉染GES-1細胞。RT-PCR檢測轉染后miR-200a/b/c及ZEB1/ZEB2 mRNA的表達;Western blot檢測轉染后ZEB1/ZEB2、基質金屬蛋白酶(MMP)-2/9、增殖細

6、胞核抗原(PCNA)蛋白的表達;Transwell侵襲實驗和劃痕實驗檢測細胞侵襲遷移能力;MTT法檢測細胞增殖活性。
　　結果：
　　第一部分:Real-time PCR顯示ZEB23'UTR轉染后，miR-200a/b/c的表達均明顯下調，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，以miR-200b最為明顯，而siRNA干擾ZEB2基因后miR-200a/b/c表達則均上調。轉染ZEB23'UTR質粒組細胞的遷移、侵襲活性均較對

7、照組增強，而轉染ZEB2 siRNA后，SGC7901細胞的遷移、侵襲則有明顯減弱。蛋白印跡法顯示ZEB23'UTR轉染導致ZEB2表達上調，E-cadherin表達下調，而Vimentin則表達上調，而轉染ZEB2 siRNA后，各項指標則表現出相反的表達趨勢。
　　第二部分:與對照組及突變組相比，轉染ZEB23'UTR組miR-200a/b/c的表達均下調，以miR-200b最為明顯，ZEB1/ZEB2 mRNA及蛋白水平表達

8、上調，細胞遷移、侵襲、增殖活性均增強(P＜0.05)。而聯(lián)合miR-200b micmics組較ZEB23'UTR組遷移、侵襲、增殖活性降低。
　　結論：
　　ZEB23'UTR可以通過調控miR-200a/b/c的表達調控胃癌細胞EMT過程，在調節(jié)腫瘤細胞的侵襲、轉移中具有重要作用。ZEB23'UTR可能通過調控miR-200a/b/c的表達進而影響其對靶基因的轉錄后調控，增加細胞的侵襲、遷移能力，導致GES-1細胞的惡性