左氧氟沙星在GES-1細(xì)胞和MGC80-3細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運特征.pdf

1、目的:
　　研究左氧氟沙星在GES-1及MGC80-3細(xì)胞上的跨膜轉(zhuǎn)運特征及可能存在的轉(zhuǎn)運體,初步探討藥物濃度、藥物孵育時間、溫度、細(xì)胞外pH值和轉(zhuǎn)運體抑制劑環(huán)孢素A、維拉帕米、西咪替丁對藥物轉(zhuǎn)運量的影響。
　　方法:
　　(1)將 GES-1、MGC80-3細(xì)胞與含有100、200μmol·L-1的左氧氟沙星的Hanks液共孵育1、5、7.5、10、15、30、60min后收集細(xì)胞、比較不同時間,不同濃度對左氧氟沙星

2、在兩種細(xì)胞上轉(zhuǎn)運的影響。
　　(2)將 GES-1、MGC80-3細(xì)胞與不同 pH值及不同溫度的含100μmol·L-1左氧氟沙星的Hanks液共孵育30min后收集細(xì)胞,比較不同溫度,不同pH值對左氧氟沙星在兩種細(xì)胞上轉(zhuǎn)運的影響。
　　(3)將GES-1、MGC80-3細(xì)胞與含有100μmol·L-1左氧氟沙星的Hanks液及 P-糖蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑環(huán)孢素 A、維拉帕米和有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運體抑制劑西咪替丁共同孵育1、5、7.5、

3、10、15、30min后收集細(xì)胞,比較轉(zhuǎn)運體抑制劑對左氧氟沙星在兩種細(xì)胞轉(zhuǎn)運上的影響。
　　(4)收集細(xì)胞樣本后經(jīng)反復(fù)凍融3次和超聲破碎細(xì)胞,采用高效液相色譜法(HPLC)測定胞內(nèi)藥物含量,考馬斯亮藍(lán)法定量細(xì)胞蛋白總量。用細(xì)胞內(nèi)藥物含量與細(xì)胞總蛋白量的比值作為觀察藥物轉(zhuǎn)運量的檢測指標(biāo)。
　　(5)建立GES-1和MGC80-3細(xì)胞內(nèi)左氧氟沙星檢測的HPLC方法:細(xì)胞裂解樣本經(jīng)冷凍離心機(jī)12000rpm·min-1離心15mi

4、n,取上清加等體積甲醇沉淀蛋白,再次取上清并經(jīng)微孔濾膜過濾,用于測定左氧氟沙星濃度,HPLC條件:流動相為乙腈-50mmol·L-1檸檬酸溶液-1mol·L-1醋酸銨溶液(17:82:1;v/v/v),Welch C18分析柱,流速1.0ml·min-1,紫外檢測波長295nm,柱溫40℃,進(jìn)樣量20μl。評價專屬性、線性、準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性和靈敏度。
　　結(jié)果:
　　(1)GES-1和MGC80-3細(xì)胞的藥物轉(zhuǎn)運量,1

5、-5min時明顯增加,7.5-15min緩慢增加并達(dá)到穩(wěn)態(tài)。100μmol·L-1左氧氟沙星孵育1、30min時GES-1胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是0.945±0.030μg/mg、1.198±0.086μg/mg。100μmol·L-1左氧氟沙星孵育1、30min時 MGC80-3胞內(nèi)轉(zhuǎn)運量分別是0.734±0.025μg/mg、1.007±0.041μg/mg。
　　(2) GES-1和MGC80-3細(xì)胞的藥物轉(zhuǎn)運量,胞外左氧氟沙星

6、濃度為200μmol·L-1時明顯大于100μmol·L-1(P<0.05)。100μmol·L-1、200μmol·L-1左氧氟沙星孵育30min時GES-1胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是1.198±0.086μg/mg、1.618±0.215μg/mg。100μmol·L-1、200μmol·L-1左氧氟沙星孵育30min時MGC80-3胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是1.007±0.041μg/mg、1.414±0.052μg/mg。
　　(3)

7、GES-1和MGC80-3細(xì)胞的藥物轉(zhuǎn)運量,孵育溫度為37℃時最大,37℃大于25℃(P>0.05),但明顯大于4℃(P<0.01)。100μmol·L-1左氧氟沙星置于37℃、25℃、4℃孵育30min時GES-1胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是1.173±0.057μg/mg、1.024±0.080μg/mg、0.642±0.099μg/mg。100μmol·L-1左氧氟沙星置于37℃、25℃、4℃孵育30min時 MGC80-3胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量

8、分別是1.001±0.072μg/mg、0.846±0.056μg/mg、0.599±0.048μg/mg。
　　(4)GES-1和MGC80-3細(xì)胞的藥物轉(zhuǎn)運量,pH值為7.4時最大,pH7.4大于pH6.4和pH8.4(P>0.05),但明顯大于pH值為5.4時(P<0.01)。100μmol·L-1左氧氟沙星在pH5.4、pH6.4、pH7.4、pH8.4下孵育30min時GES-1胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是0.822±0.047

9、μg/mg、1.078±0.076μg/mg、1.209±0.047μg/mg、1.090±0.070μg/mg。100μmol·L-1左氧氟沙星在pH5.4、pH6.4、pH7.4、pH8.4下孵育30min時MGC80-3細(xì)胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是0.724±0.036μg/mg、0.913±0.061μg/mg、1.040±0.094μg/mg、0.902±0.091μg/mg。
　　(5)P-糖蛋白抑制劑(環(huán)孢素 A、維拉帕米

10、)作用組,GES-1和MGC80-3細(xì)胞上的藥物轉(zhuǎn)運量相近。100μmol·L-1左氧氟沙星+10μmol·L-1環(huán)孢素 A孵育GES-1和MGC80-3細(xì)胞30min,胞內(nèi)藥物轉(zhuǎn)運量分別是1.311±0.0850μg/mg、1.363±0.072μg/mg。各個時間點下,兩種細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)運量都較對照組增加,GES-1細(xì)胞的藥物轉(zhuǎn)運量較對照組增加約2.07％-13.23%(P>0.05),MGC80-3細(xì)胞的藥物轉(zhuǎn)運量較對照組增加約17.

11、51%-35.30%(P<0.05)。在有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運體抑制劑(西咪替丁)作用下兩種細(xì)胞藥物轉(zhuǎn)運量較對照組無明顯改變。
　　結(jié)論:
　　(1)左氧氟沙星在GES-1細(xì)胞和MGC80-3細(xì)胞上存在跨膜轉(zhuǎn)運,轉(zhuǎn)運有明顯的濃度、時間、溫度、pH值依賴性。P-糖蛋白可能參與左氧氟沙星在GES-1細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運,P-糖蛋白參與了左氧氟沙星在MGC80-3細(xì)胞上的轉(zhuǎn)運。有機(jī)陽離子轉(zhuǎn)運體不參與左氧氟沙星在GES-1和MGC80-3細(xì)胞上的轉(zhuǎn)