伏馬菌素對GES-1細(xì)胞HLA-Ⅰ類分子及其抗原加工轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)分子LMP2、TAP1影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-Ⅰ類分子分布于所有有核細(xì)胞表面，由一條α重鏈（被糖基化的）和一條β2-微球蛋白（β2m）輕鏈非共價(jià)結(jié)合而成。HLA-Ⅰ類分子可與內(nèi)源性抗原（如細(xì)胞感染病毒后產(chǎn)生病毒蛋白或基因突變產(chǎn)生的突變蛋白）肽結(jié)合，并將其提呈給CD8+T細(xì)胞，誘發(fā)特異性細(xì)胞殺傷效應(yīng)，在機(jī)體抗病毒感染、監(jiān)視和清除體內(nèi)突變細(xì)胞過程中起著重要的作用。其中，HLA-A、B、C是經(jīng)典的HIA-Ⅰ類

2、分子。多功能蛋白酶2（large multifunctional protease，LMP2）是組成細(xì)胞內(nèi)蛋白酶體（proteasome）的亞基之一，能夠?qū)?nèi)源性抗原降解成多肽，后者與轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白（transporter associated protein，TAP）相結(jié)合。TAP1是組成TAP的亞單位之一，可以將蛋白酶體產(chǎn)生的多肽轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中使之與新合成的HLA-Ⅰ類分子相結(jié)合，進(jìn)而呈遞至細(xì)胞表面供T細(xì)胞識別。HLA-Ⅰ類分子的正

3、常表達(dá)以及內(nèi)源性抗原肽的加工和轉(zhuǎn)運(yùn)是維持機(jī)體免疫監(jiān)視功能的重要環(huán)節(jié)。有研究表明，一些致癌性的環(huán)境因素可降低正常細(xì)胞表面HLA-Ⅰ類分子的表達(dá)，使細(xì)胞逃避免疫監(jiān)視作用，為其發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化提供可能。
　　 伏馬菌素B1（FumonisinB1，F(xiàn)B1）是由串珠鐮刀菌（Fusarium moniliforme）產(chǎn)生的代謝物，主要污染玉米、小麥、大米及豆類等糧食作物。FB1可以引起馬腦白質(zhì)軟化綜合征、豬肺水腫和鼠肝腎損傷，且其促癌性和致癌

4、性已在大鼠中得到證實(shí)。另外，流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，F(xiàn)B1可能與食管癌的發(fā)生有密切關(guān)系。而目前對FB1的研究多集中在檢測方法、對動物及其細(xì)胞株的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)上，而對于人體免疫功能影響的研究國內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究擬通過觀察不同劑量和不同作用時(shí)間的FB1對體外培養(yǎng)的人胃粘膜上皮GES-1細(xì)胞中經(jīng)典的HLA-Ⅰ類分子（HLA-A，B，C）、β2m、LMP2和TAP1基因在mRNA和蛋白水平表達(dá)的影響，以期揭示其對胃上皮細(xì)胞內(nèi)源性抗原加工、轉(zhuǎn)運(yùn)及表

5、達(dá)的作用及其機(jī)制，為某些消化道腫瘤的治療和預(yù)防提供依據(jù)。
　　 方法：用含10％胎牛血清，105 U/L青霉素，100mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃，5％CO2條件溫箱中體外培養(yǎng)正常人胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1細(xì)胞，細(xì)胞呈貼壁生長。選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞（傳代后24h）隨機(jī)分為對照組和處理組。在劑量和時(shí)間效應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)B1作用劑量和時(shí)間的設(shè)計(jì)以Neera等人為參考并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在量效研究中，處理組加入FB1，使其終濃度

6、分別為5，10和20μM，作用時(shí)間均為24h；在時(shí)效研究中，根據(jù)量效研究結(jié)果選擇20μM FB1為處理濃度，作用時(shí)間分別為2，6，12，24，36，48和72h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均設(shè)置相應(yīng)的對照組。經(jīng)FB1作用后，常規(guī)細(xì)胞刮匙刮除并離心收集細(xì)胞。
　　 2反轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）檢測mRNA的表達(dá)
　　 2.1細(xì)胞總RNA的提取、鑒定及定量
　　 采用異硫氰酸胍一步法提取細(xì)胞總RNA。1％瓊脂糖電泳鑒定其完整性。

7、紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。
　　 2.2 RT-PCR方法
　　 應(yīng)用RT-PCR方法檢測不同劑量和不同作用時(shí)間的FB1對GES-1細(xì)胞HLA-A，B，C、β2m、LMP2和TAP1 mRNA表達(dá)的影響。采用凝膠分析軟件（BIO-LD）進(jìn)行定量分析，各組以目的基因與內(nèi)參照基因GAPDH量的比值來表示目的基因的相對表達(dá)量。
　　 3蛋白免疫印跡（Western blot）檢測蛋白的表達(dá)
　　 3.1細(xì)胞總蛋白

8、的提取和定量
　　 應(yīng)用預(yù)冷的細(xì)胞胞膜裂解液和胞漿裂解液分別加入收集的細(xì)胞中，以提取細(xì)胞的胞膜蛋白和總蛋白。將提取的蛋白應(yīng)用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。
　　 3.2 Western blot方法
　　 提取的細(xì)胞總蛋白，應(yīng)用Western blot方法檢測不同劑量和不同作用時(shí)間的FB1對GES-1細(xì)胞HLA-A，B，C、β2m、LMP2和TAP1蛋白表達(dá)水平的影響。所檢測的四種蛋白的分子量分別為43～45 kD、1

9、2KD、21～24KD和64KD。
　　 4免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）染色（SP法）
　　 細(xì)胞爬片后，檢測不同劑量的FB1（0，5，10，20μM）處理后GES-1細(xì)胞中HLA-A，B，C、β2m、LMP2和TAP1的表達(dá)情況。
　　 5統(tǒng)計(jì)
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行Pearson相關(guān)分析與單因素方差分析（analysis of variance，ANOVA），結(jié)果用x±s表示。
　

10、　 結(jié)果：
　　 1 FB1對GES-1細(xì)胞HIA-Ⅰ類分子表達(dá)的影響
　　 1.1 FB1對GES-1細(xì)胞HLA-Ⅰ類分子重鏈（HLA-A，B，C）表達(dá)的影響
　　 1.1.1 FB1對GES-1細(xì)胞HLA-Ⅰ類分子重鏈HLA-A，B，C表達(dá)的量效作用
　　 RT-PCR結(jié)果顯示：不同濃度的FB1處理后，HLA-AmRNA的相對表達(dá)量隨作用濃度的升高逐漸降低（r=-0.767，P<0.01）。中、高劑

11、量（10μM和20μM）的FB1處理組中，HLA-B mRNA的相對表達(dá)量均明顯低于對照組水平（P<0.05），而低劑量組（5μM）表達(dá)水平未見明顯改變（P>0.05）。
　　 各濃度處理組HLA-C mRNA相對表達(dá)量與對照組水平相比均未見顯著性差異（P>0.05）。
　　 Western blot檢測結(jié)果顯示：不同濃度的FB1處理后，HLA-A，B，C的相對表達(dá)量隨作用濃度的升高逐漸降低（r=-0.848，P<0.0

12、1）。
　　 ICC染色結(jié)果也顯示：FB1處理組HLA-A，B，C蛋白的相對表達(dá)量與對照組水平相比均明顯降低（P<0.05）。
　　 1.1.2 FB1對GES-1細(xì)胞HLA-A，B，C表達(dá)的時(shí)效作用
　　 RT-PCR結(jié)果顯示：經(jīng)20μM FB1作用不同時(shí)間后，在24、48、36和72h處理組中，HLA-A mRNA的相對表達(dá)量均明顯低于各自的對照組水平（P<0.05）；而處理2、6和12h，與對照組水平相比均

13、無顯著性差異（P>0.05）。其中，2-24h內(nèi)，隨處理時(shí)間延長，細(xì)胞中HLA-A mRNA的相對表達(dá)量逐漸降低（r=-0.792，P<0.01）；而在24-72h內(nèi)隨時(shí)間延長逐漸升高但二者間未見明顯相關(guān)關(guān)系（r=0.334.P>0.05）。
　　 HLA-B mRNA的表達(dá)量僅在12、24和36h處理組中顯著低于相應(yīng)的對照組水平（P>0.05）。在2-12內(nèi)隨作用時(shí)間延長而逐漸下降（r=-0.683，P<0.01）；在12-7

14、2h內(nèi)隨作用時(shí)間延長逐漸緩慢趨于升高但未見明顯相關(guān)關(guān)系（r=0.182，P>0.05）。在12、24和36h處理組中，HLA-B mRNA的相對表達(dá)量與相應(yīng)的對照組水平相比均明顯降低（P<0.05）。
　　 在72h內(nèi)，20μM FB1作用不同時(shí)間后，HLA-C mRNA的表達(dá)均未見明顯差異（P>0.05）。
　　 Western blot檢測結(jié)果顯示：20μM的FB1分別作用12、24、36、48和72h時(shí)，HLA-A

15、，B，C蛋白的表達(dá)均明顯低于相應(yīng)的對照組水平（P<0.05）；而作用2和6h時(shí)對HIA-A，B，C蛋白的表達(dá)無明顯影響（P>0.05）。另外，HLA-A，B，C蛋白的相對表達(dá)量在2-24h內(nèi)隨作用時(shí)間延長呈逐漸下降趨勢（r=-0.770，P<0.01），隨后在24-72h內(nèi)隨時(shí)間延長逐漸升高（r=0.976，P<0.01）。
　　 1.2 FB1對GES-1細(xì)胞β2m表達(dá)的影響
　　 1.2.1 FB1對GES-1細(xì)胞β

16、2m表達(dá)的量效作用
　　 RT-PCR結(jié)果顯示：各濃度處理組β2m mRNA的相對表達(dá)量改變與對照組水平相比均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　 蛋白水平上，Western blot及免疫細(xì)胞化學(xué)染色檢測結(jié)果均顯示FB1各劑量處理組β2m表達(dá)量與對照組水平相比均無顯著性差異（P>0.05）。
　　 1.2.2 FB1對GES-1細(xì)胞β2m表達(dá)的時(shí)效作用
　　 RT-PCR結(jié)果顯示：在各時(shí)間段內(nèi)β2m

17、 mRNA的相對表達(dá)量與對照組水平相比未見顯著性差異（P>0.05）。
　　 Western blot檢測結(jié)果顯示：β2m蛋白的相對表達(dá)量較之相應(yīng)的對照組水平未見明顯差異（P>0.05）。
　　 2 FB1對GES-1細(xì)胞LMP2表達(dá)的影響
　　 2.1 FB1對GES-1細(xì)胞LMP2表達(dá)的量效作用
　　 2.2 FB1對GES-1細(xì)胞LMP2表達(dá)的時(shí)效作用
　　 3 FB1對GES-1細(xì)胞TAP

18、1表達(dá)的影響
　　 3.1 FB1對GES-1細(xì)胞TAP1表達(dá)的量效作用
　　 3.2 FB1對GES-1細(xì)胞TAP1表達(dá)的時(shí)效作用
　　 結(jié)論：
　　 1 FB1能夠在mRNA和蛋白水平上抑制GES-1細(xì)胞HLA-Ⅰ類分子的表達(dá)。
　　 2 FB1能夠在mRNA和蛋白水平上抑制GES-1細(xì)胞LMP2和TAP1的表達(dá)。
　　 3不同劑量、不同作用時(shí)間的FB1對GES-1細(xì)胞HLA-CmRN