食管鱗癌中HLA-Ⅰ類抗原和APM主要分子異常表達與免疫治療實驗研究.pdf

1、我國是世界上食管癌發(fā)病率和死亡率最高的國家。盡管近年來手術(shù)和放化療已取得不少進展，但其5年生存率仍徘徊在15％左右，因此急需尋找新型輔助治療手段。隨著腫瘤免疫學突破性的進展，腫瘤特異性免疫治療的研究成為最具應(yīng)用潛力的研究領(lǐng)域。目前雖然已有多種腫瘤疫苗進入臨床驗證，但大多療效不盡如人意，其原因與腫瘤細胞中HLA-I類抗原和APM分子表達低下或缺失，從而逃逸宿主免疫監(jiān)視密切相關(guān)。宮頸癌、肺癌、頭頸鱗癌、卵巢癌和腎癌等腫瘤中已發(fā)現(xiàn)這些分子異常

2、表達。但食管癌有關(guān)這方面的報道甚少。本文分析食管癌組織和細胞株中HLA-I類抗原和APM分子(TAP1等)的表達，并在體內(nèi)外探討其表達與食管癌免疫治療的關(guān)系。
　　 首先應(yīng)用組織芯片技術(shù)檢測食管癌高發(fā)區(qū)陜西省200例食管組織(120例鱗癌和與其中40例配對的癌旁粘膜上皮和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移各40例)中HLA-I類抗原和APM分子的表達及HPV感染情況。免疫組化結(jié)果顯示，在癌旁粘膜上皮中:TAP1全部表達正常；HLA-I有50％表達正常，

3、20％表達下調(diào)，30％檢測不到；β2m有27.5％表達正常，72.5％檢測不到，提示HLA-I和β2m表達下調(diào)是食管癌發(fā)生的早期事件。同時配對的食管鱗癌和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中HLA-I和β2m的表達也嚴重下調(diào)。鱗癌組織中TAP1的表達水平低于癌旁粘膜上皮，高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織(P<0.001)，且與腫瘤分化程度顯著相關(guān)(P<0.05)。TAP1降低程度和腫瘤進展相一致，可作為反映腫瘤轉(zhuǎn)移的參考指標。114/120例食管鱗癌和40/40例淋巴結(jié)

4、轉(zhuǎn)移灶癌細胞中至少有一種以上的分子表達水平下調(diào)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的原發(fā)鱗癌組織中HLA-I，β2m和TAP1的下調(diào)率和丟失率均明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤組織(P<0.05)。
　　 原位雜交法檢測HPV感染結(jié)果表明:40例配對的食管鱗癌、癌旁粘膜上皮和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織標本中，HPV16/18的檢出率分別為57.5％、52.5％和42.5％，提示HPV感染率較高，但各組間無顯著差異。進一步分析表明HPV感染與HLA-I類抗原及APM主要

5、分子表達情況無顯著相關(guān)性。由于高危型HPVE6和E7是公認的癌基因和理想的靶抗原，因此推測有可能成為食管癌免疫治療的靶抗原。
　　 食管癌中HLA-I類抗原和APM主要分子TAP1表達嚴重下調(diào)，提示可能是食管癌T細胞依賴性免疫治療的重要障礙之一。為了進一步建立動物模型，觀察這些分子的表達與免疫治療的關(guān)系，我們采用流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，4株食管癌(EC9706、KYSE150、KYSE510和NEC)細胞系HLA-I類復(fù)合物的表達均

6、下調(diào)。RT-PCR和WesternBlot結(jié)果表明，KYSE510細胞中組成型表達TAP2、LMP7、LMP10、PA28a，和PA28β基因；而另外3株細胞(EC9706、KYSE150和NEC)中至少一種基因表達下調(diào)或缺失；TAP1、β2m和LMP2蛋白在4株細胞系中表達明顯下調(diào)或缺失；tapasin僅在KYSE150中表達明顯下調(diào)。IFN-γ可使各基因的異常表達恢復(fù)，提示這些基因表達產(chǎn)物的下調(diào)或缺失并非由基因結(jié)構(gòu)改變(即硬損傷，h

7、ardlesion)所致，是可以經(jīng)誘導(dǎo)而重新表達，可以直接用于免疫治療研究。因此，我們選用EC9706細胞株建立了HPV16E7陽性(靶抗原)，且免疫原性低具高轉(zhuǎn)移能力(即HLA-I抗原及APM主要分子表達下調(diào))的人食管癌Hu-PBL-SCID小鼠模型。
　　 研究發(fā)現(xiàn)在上述模型中，HHP蛋白疫苗能有效的抑制小鼠體內(nèi)EC9706腫瘤細胞的生長，抑瘤率達55％左右，而且可以明顯延長荷瘤小鼠的生存時間。CTL和Elispot結(jié)果表明

8、，HHP蛋白免疫組小鼠脾臟中存在大量E6/E7抗原特異性淋巴細胞，并可誘發(fā)以EC9706為靶細胞的特異性CTL反應(yīng)。HE和免疫組化結(jié)果表明，HHP蛋白免疫組腫瘤組織中有明顯的CD8+T淋巴細胞浸潤。同時，HHP蛋白免疫組腫瘤組織中IFN-γ表達水平明顯高于對照組，且HLA-I類抗原和APM分子(TAP1/2，LMP2，PA28β)表達明顯上調(diào)。為了進一步證實細胞HLA-I類抗原表達上調(diào)可增強免疫治療效果，我們用IFN-γ處理前/后的EC

9、9706細胞作為靶細胞，以三組小鼠脾臟中的人淋巴細胞作為效應(yīng)細胞進行CTL活性測定，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)處理的細胞相比，HHP蛋白免疫組小鼠脾臟細胞對經(jīng)IFN-γ處理的食管癌細胞有明顯高的殺傷效應(yīng)(P<0.05)。
　　 綜上，本研究首次報告我國食管癌高發(fā)區(qū)陜西省食管癌組織中HLA-I類抗原和APM分子TAP1表達明顯下調(diào)，可能是其免疫逃逸的重要原因之一，且該地區(qū)患者HPV感染率較高；建立了HPV陽性、HLA-I類抗原和APM分子表達下調(diào)