赭曲霉毒素A對(duì)人胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)和食管黏膜上皮細(xì)胞(Het-1A)DNA和染色體損傷作用的研究.pdf

1、目的：赭曲霉毒素A(OTA)是一種由純綠青霉（Penicillium verrucosum）、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)和碳黑曲霉(A.carbonarius)產(chǎn)生的在自然界中廣泛存在的真菌毒素。研究發(fā)現(xiàn)，小麥、玉米等糧食作物及其制品中OTA的污染情況相當(dāng)普遍，當(dāng)人和動(dòng)物食用了被OTA污染的食物和飼料后，其血液、膽汁、尿液、乳汁中均可檢測(cè)到OTA的殘留物。目前已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)OTA具有肝毒性、腎毒性、免疫毒性、神

2、經(jīng)毒性、致畸性、致突變性和致癌性等生物學(xué)效應(yīng)。1993年OTA被國(guó)際癌癥研究中心列為“人類可能的致癌物”。
　　 2006年，實(shí)驗(yàn)室對(duì)河北省中南部太行山區(qū)食管癌和胃癌高發(fā)區(qū)磁縣和贊皇縣居民糧食中OTA的污染狀況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩地居民食用的小麥中OTA的檢出率為37.70％，其中OTA的最低含量為0.23μg/kg，最高含量達(dá)到14.25μg/kg，均明顯高于世界衛(wèi)生組織/糧農(nóng)組織聯(lián)合專家委員會(huì)(Joint FAO/WHO E

3、xpert Committee on Food Additives，JECFA)暫定的每周容許攝入量100ng/kg。鑒于OTA在食管癌、胃癌高發(fā)區(qū)糧食中的高污染情況以及人類的可能致癌性，探討OTA與當(dāng)?shù)鼐用袷彻馨?、胃癌的發(fā)生的可能關(guān)系對(duì)胃癌防治具有非常重要的意義。
　　 DNA是機(jī)體生命活動(dòng)最重要的遺傳物質(zhì)，染色體是遺傳物質(zhì)的載體，是由一條雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA鏈與組蛋白結(jié)合而成的。DNA是致癌性物質(zhì)攻擊的主要靶分子，致癌性物質(zhì)能

4、夠直接或間接損傷DNA，從而使DNA在復(fù)制過(guò)程中發(fā)生DNA核苷酸序列永久性的改變，進(jìn)而導(dǎo)致染色體發(fā)生斷裂，從而使腫瘤更加易于形成。但是目前有關(guān)OTA對(duì)人胃黏膜上皮細(xì)胞和食管黏膜上皮細(xì)胞DNA和染色體影響的研究在國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究擬用永生化人正常胃黏膜上皮細(xì)胞(GES-1)和人正常食管黏膜上皮細(xì)胞(Het-1A)作為研究對(duì)象，應(yīng)用染色體核型分析技術(shù)和單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞水平上檢測(cè)OTA對(duì)GES-1細(xì)胞和Het-1

5、A細(xì)胞染色體及DNA的損傷情況。以期揭示OTA暴露與人胃黏膜和食管黏膜的損傷乃至胃癌、食管癌發(fā)生的關(guān)系，這對(duì)于提高我國(guó)農(nóng)村居民，特別是胃癌、食管癌高發(fā)區(qū)居民食品的衛(wèi)生安全具有重要意義。
　　 方法：
　　 1、細(xì)胞培養(yǎng)及處理
　　 正常人胃黏膜上皮細(xì)胞株GES-1、人食管黏膜上皮細(xì)胞株Het-1A細(xì)胞株培養(yǎng)，傳代24h后選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，隨機(jī)分為溶劑對(duì)照組和OTA處理組。OTA處理組分別予以終濃度為2.5μm

6、ol/L、5μmol/L、10μmol/L及20μmol/L處理24h；10μmol/LOTA分別作用6h、12h、24h和36h，于實(shí)驗(yàn)處理相應(yīng)的時(shí)間后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。
　　 2、單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)DNA的損傷情況
　　 2.1采用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OTA(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)作用GES-1細(xì)胞和Het-1A細(xì)胞24h后Tail DNA％、Tail

7、Length、Olive Tail Moment的變化情況。
　　 2.2采用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)10μmol/L OTA分別處理GES-1細(xì)胞和Het-1A細(xì)胞6h、12h、24h、36h后Tail DNA％、Tail Length、Olive Tail Moment的變化情況。
　　 3染色體核型分析實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞染色體畸變情況3.1利用染色體核型分析觀察OTA作用于GES-1細(xì)胞(2.5μmol/L、5μmol/L

8、、10μmol/L)以及Het-1A細(xì)胞(2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)24h后染色體發(fā)生的變化情況。
　　 3.2利用染色體核型分析觀察10μmol/L OTA分別處理GES-1細(xì)胞和Het-1A細(xì)胞6h、12h、24h、36h后細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)和數(shù)目的變化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、OTA對(duì)GES-1細(xì)胞DNA的損傷作用
　　 1.1不同濃度OTA對(duì)GES-

9、1細(xì)胞DNA的損傷作用：?jiǎn)渭?xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度OTA處理GES-1細(xì)胞24h后，各處理組的彗星率均顯著高于溶劑對(duì)照組，且在2.5～20μmol/L范圍內(nèi)隨處理濃度的增加，彗星率明顯增加，呈顯著劑量依賴關(guān)系。進(jìn)一步對(duì)溶劑對(duì)照組以及OTA處理組細(xì)胞在彗星Tail DNA％、Tail Length及Olive Tail Moment三個(gè)指標(biāo)間的差異進(jìn)行分析。與溶劑對(duì)照組比較，各OTA處理組GES-1細(xì)胞的彗星Tail DNA％值

10、均高于溶劑對(duì)照組，且隨著OTA濃度升高其值亦相應(yīng)增加，呈明顯劑量依賴關(guān)系。此外，Tail Length以及Olive Tail Moment變化與Tail DNA值變化相一致，均表現(xiàn)為明顯劑量依賴關(guān)系。
　　 1.210μmol/L OTA處理不同時(shí)間對(duì)GES-1細(xì)胞DNA的損傷作用：10μmol/LOTA處理6～36 h后，各處理組的彗星率均顯著高于溶劑對(duì)照組，且彗星率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增高。同時(shí)觀察彗星Tail DNA％、

11、Tail Length以及Olive Tail Moment的值發(fā)現(xiàn)均分別高于溶劑對(duì)照組，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)上述指標(biāo)明增加顯著，存在明顯的時(shí)間依賴性關(guān)系。
　　 2、OTA對(duì)Het-1A細(xì)胞DNA的損傷作用
　　 2.1不同濃度OTA處理：對(duì)Het-1A細(xì)胞DNA的損傷作用單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Het-1A細(xì)胞經(jīng)不同濃度的OTA處理24h后，各處理組的彗星率均明顯高于溶劑對(duì)照組，且隨OTA濃度升高，彗星率也相應(yīng)增

12、加，呈明顯劑量依賴關(guān)系。接下來(lái)觀察并分析彗星Tail DNA％、Tail Length及Olive Tail Moment發(fā)現(xiàn)，以上三個(gè)指標(biāo)的值均顯著高于溶劑對(duì)照組，且在2.5～20μmol/L范圍內(nèi)，隨著OTA濃度升高而相應(yīng)增加，呈明顯的劑量依賴關(guān)系(Tail DNA％值：r=0.909,P＜0.05; Tail Length:r=0.887,P＜0.05; Olive TailMoment:r=0.995,P＜0.05)2.210μ

13、mol/LOTA處理不同時(shí)間對(duì)Het-1A細(xì)胞DNA的損傷作用10μmol/LOTA處理6～36h后，各處理組的彗星率均顯著高于溶劑對(duì)照組，且隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，彗星率明顯增加，存在明顯時(shí)間依賴關(guān)系。同時(shí)對(duì)彗星TailDNA％、Tail Length及OliveTail Moment進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)在6～36h內(nèi)，隨著OTA作用時(shí)間的延長(zhǎng)，以上三個(gè)指標(biāo)的值均相應(yīng)增加，呈明顯的時(shí)間依賴關(guān)系。
　　 3、OTA對(duì)GES-1細(xì)胞染色體

14、核型的影響
　　 3.1不同濃度OTA對(duì)GES-1細(xì)胞染色體核型的影響：染色體核型分析表明，2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L OTA分別處理GES-1細(xì)胞24h，染色體結(jié)構(gòu)異常和數(shù)目異常的發(fā)生率增加，其中10μmol/LOTA處理組染色體畸變率明顯高于溶劑對(duì)照組。
　　 3.210μmol/L OTA處理GES-1細(xì)胞染色體核型的影響：10μmol/L OTA分別處理6h、12h、24h及36h，細(xì)胞

15、染色體結(jié)構(gòu)異常和數(shù)目異常的發(fā)生率增加，其中12h、24h和36h組染色體畸變率明顯高于溶劑對(duì)照組。
　　 4、OTA對(duì)Het-1A細(xì)胞染色體核型的影響
　　 4.1不同濃度OTA處理Het-1A細(xì)胞染色體核型的影響：染色體核型分析結(jié)果示，2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L OTA處理后染色體畸變率分別為9.00％、9.00％、10.00％、15.00％，均明顯高于溶劑對(duì)照組。
　

16、　 4.210μmol/L OTA處理：不同時(shí)間Het-1A細(xì)胞染色體核型的影響10μmol/L OTA分別作用Het-1A細(xì)胞6h、12h、24h、36h后，細(xì)胞染色體結(jié)構(gòu)異常和數(shù)目異常發(fā)生率增加，其中12h、24h和36h組染色體畸變率均較溶劑對(duì)照組明顯升高。
　　 5、OTA對(duì)GES-1細(xì)胞和Het-1A細(xì)胞DNA及染色體的損傷的比較
　　 不同濃度(2.5～20μmol/L)、不同時(shí)間(6～36h)OTA作用于

17、GES-1細(xì)胞和Het-1A細(xì)胞后，DNA損傷指標(biāo)包括彗星的發(fā)生率、Tail DNA％、Tail Length、Olive Tail Moment均明顯增加，OTA誘導(dǎo)的這兩株細(xì)胞的DNA損傷無(wú)明顯差異。OTA劑量達(dá)到10μmol/L方可誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞的染色體發(fā)生顯著畸變，但OTA劑量為2.5μmol/L和5μmol/L時(shí)即能引起Het-1A細(xì)胞染色體發(fā)生顯著畸變，提示Het-1A細(xì)胞對(duì)低濃度OTA較GES-1細(xì)胞更為敏感。

18、　　 結(jié)論：
　　 1、OTA可以劑量及時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞和Het-1A細(xì)胞DNA損傷，其彗星率、彗星Tail DNA％、Tail Length、Olive Tail Moment值均較溶劑對(duì)照組明顯增高。
　　 2、OTA可以誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞和Het-1A細(xì)胞染色體發(fā)生結(jié)構(gòu)異常（雙著絲粒、斷裂、空隙、環(huán)）和數(shù)目異常（多倍體）。
　　 3、OTA引起的GES-1細(xì)胞和Het-1A細(xì)胞的DNA損傷情