人肝癌干-祖樣細(xì)胞對肝臟損傷作用的研究.pdf

1、目的:
　　 觀察從肝癌細(xì)胞系中分離的肝癌干/祖樣細(xì)胞(Hepatocarcinoma stem cell，HSC)對NOD/SCID小鼠生存時(shí)間的影響，并從體內(nèi)和體外兩方面初步探討其引起NOD/SCID小鼠死亡的可能原因。
　　 方法:
　　 1.無血清懸浮培養(yǎng)法分離培養(yǎng)肝癌SK-Hep-1細(xì)胞中的肝癌于/祖樣細(xì)胞（球形體細(xì)胞，spheroid cells，SC）;
　　 2.應(yīng)用MTS和流式細(xì)胞術(shù)觀察

2、球形體細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期分布的情況;
　　 3.軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察球形體細(xì)胞的自我更新、無限增殖能力;NOD/SCID小鼠體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)觀察球形體細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力;
　　 4.應(yīng)用MTS法檢測球形體細(xì)胞對化療藥物（5-Fu、DDP、ADM和NVB）的敏感性;
　　 5.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和免疫印跡法觀察球形體細(xì)胞干細(xì)胞基因Oct-4、Nanog、BMI-1、Notch-1以及SMO mRNA和蛋白的表達(dá)水

3、平;
　　 6.肝癌干/祖樣細(xì)胞接種NOD/SCID小鼠觀察肝癌干/祖樣細(xì)胞對荷瘤小鼠生存時(shí)間的影響;
　　 7.HE染色顯微鏡下觀察NOD/SCID小鼠各個(gè)臟器組織結(jié)構(gòu)的變化;檢測肝癌干/祖樣細(xì)胞對NOD/SCID小鼠血液生化指標(biāo)（肝功能）的影響，應(yīng)用Tunel和PCNA染色觀察肝癌干/祖樣細(xì)胞對小鼠肝臟凋亡及增殖情況的影響;
　　 8.膠原酶消化法分離小鼠原代肝細(xì)胞并培養(yǎng);
　　 9.流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合C

4、FSE染色檢測肝癌干/祖樣細(xì)胞體外對小鼠和人正常肝細(xì)胞增殖的影響;
　　 10.流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合AnnexinV/PI雙染檢測肝癌干/祖樣細(xì)胞體外對小鼠和人正常肝細(xì)胞凋亡的影響;
　　 11.流式細(xì)胞術(shù)聯(lián)合PI染色檢測肝癌干/祖樣細(xì)胞體外對小鼠和人正常肝細(xì)胞周期分布的影響。
　　 結(jié)果:
　　 1.SK-Hep-1細(xì)胞可在添加生長因子的無血清培養(yǎng)基中呈球形懸浮生長并可長期培養(yǎng)、擴(kuò)增。
　　 2.球形

5、體細(xì)胞呈低增殖狀態(tài)，大多數(shù)處于靜止期，即細(xì)胞周期G0/G1期。
　　 3.球形體細(xì)胞和SK-Hep-1細(xì)胞在雙層軟瓊脂培養(yǎng)基中均可呈克隆性生長，球形體細(xì)胞克隆形成率為51.63％，顯著高于SK-Hep-1細(xì)胞，具有更強(qiáng)的克隆形成能力;體內(nèi)成瘤性實(shí)驗(yàn)顯示球形體細(xì)胞具有較強(qiáng)的致瘤能力，1000個(gè)球形體細(xì)胞接種于NOD/SCID小鼠皮下即可形成腫瘤，并能分化出與原代細(xì)胞特征相仿的腫瘤細(xì)胞。
　　 4.藥物敏感性分析結(jié)果顯示，經(jīng)

6、不同化療藥物作用48hrs，球形體細(xì)胞活性明顯高于SK-Hep-1細(xì)胞，對化療藥物具有更強(qiáng)的耐受性。
　　 5.球形體細(xì)胞中干細(xì)胞基因Oct4、Nanog、BMI-1、Notch1、和SMO mRNA和蛋白的表達(dá)水平明顯高于SK-Hep-1細(xì)胞。
　　 6.生存分析可見HSC接種的NOD/SCID小鼠組生存時(shí)間與SK-Hep-1組相比明顯縮短。
　　 7.HE染色顯微鏡下觀察HSC組小鼠的肝臟組織肝索紊亂，肝細(xì)胞

7、呈大小不等的空泡樣變，嗜酸性變，可見小灶性壞死，肝竇擴(kuò)張，單核巨噬細(xì)胞重度增生，病變較SK-Hep-1組明顯加重;HSC組小鼠肝功能指標(biāo)中白蛋白水平下降，ALT水平升高;Tunel結(jié)果顯示HSC組小鼠肝組織凋亡細(xì)胞的數(shù)量較SK-Hep-1組明顯增加;PCNA染色結(jié)果顯示SK-Hep-1和HSC組小鼠的肝組織均有PCNA陽性細(xì)胞，但是與SK-Hep-1組相比，HSC組的陽性細(xì)胞較少。
　　 8.小鼠原代肝細(xì)胞體積大，呈多邊形或不規(guī)

8、則形，單核或雙核，細(xì)胞界限清楚。
　　 9.HSC細(xì)胞培養(yǎng)上清及HSC與肝細(xì)胞共培養(yǎng)均能夠抑制肝細(xì)胞的增殖，與SK-Hep-1細(xì)胞相比，HSC對肝細(xì)胞增殖抑制的作用更為明顯。
　　 10.HSC細(xì)胞培養(yǎng)上清能夠誘導(dǎo)肝細(xì)胞的凋亡，與SK-Hep-1細(xì)胞比較，HSC上清對肝細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用更加明顯。HSC和SK-Hep-1細(xì)胞與正常肝細(xì)胞共培養(yǎng)對肝細(xì)胞凋亡均沒有影響。
　　 11.HSC細(xì)胞培養(yǎng)上清及HSC細(xì)胞與肝

9、細(xì)胞共培養(yǎng)均能夠引起肝細(xì)胞S期百分比升高，G0/G1、G2/M期百分比均出現(xiàn)不同程度的降低，與SK-Hep-1細(xì)胞相比，HSC對肝細(xì)胞具有更強(qiáng)的細(xì)胞周期阻滯作用。
　　 結(jié)論:
　　 經(jīng)無血清懸浮培養(yǎng)法從人肝癌SK-Hep-1細(xì)胞系中分離得到了具有腫瘤干細(xì)胞特性的肝癌干/祖樣細(xì)胞(Hepatocarcinoma stem-like cell，HSC)亞群;HSC在體內(nèi)表現(xiàn)出較強(qiáng)的肝損傷作用，促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡，并且抑制肝細(xì)胞