熱作用對(duì)人肝癌細(xì)胞株MHCC97作用的相關(guān)研究.pdf

1、原發(fā)性肝癌主要以肝細(xì)胞肝癌（HCC）為主，是我國(guó)常見的惡性腫瘤。早期治療主要以手術(shù)切除為主。非手術(shù)療法包括全身化學(xué)藥物治療、分子靶向治療和局部物理化學(xué)治療等。熱療是近年出現(xiàn)的一種較新的腫瘤治療方法，目前已經(jīng)取得了較為確切的臨床療效。它可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，阻滯腫瘤細(xì)胞的有絲分裂周期，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，正向調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。但是由于其作用機(jī)制研究尚欠充分，影響了腫瘤熱療在臨床實(shí)踐的深入應(yīng)用。
　　人NDRG2基因即N-Myc

2、下游調(diào)節(jié)基因（N-myc down-stream regulated gene2），屬于NDRG家族。前期關(guān)于該基因的研究證實(shí)，NDRG2可以在很多正常組織中存在，參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)等多種生理過(guò)程。在結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤等一些腫瘤組織中，NDRG2表達(dá)降低，但是在某些腫瘤細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)NDRG2基因表達(dá)上調(diào)。有學(xué)者推測(cè)其可能作為一種抑癌基因參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
　　本研究通過(guò)觀察單次和多次熱作用對(duì)肝

3、癌細(xì)胞株 MHCC97細(xì)胞增殖、凋亡、周期以及NDRG2和HSP70蛋白表達(dá)的變化，初步探討熱療可能的分子作用機(jī)制。
　　研究方法和內(nèi)容：
　　將MHCC97細(xì)胞隨機(jī)分為1個(gè)對(duì)照組和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組，實(shí)驗(yàn)組以43℃恒溫進(jìn)行單次加熱，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別加熱0.5h、1h、1.5h、2h，對(duì)照組不加熱。5組細(xì)胞分別于培養(yǎng)時(shí)間3h、6h、9h、12h、24h后，觀察MHCC97細(xì)胞的形態(tài)改變，MTT法觀察各組細(xì)胞的增殖抑制情況，流式細(xì)胞術(shù)檢

4、測(cè)各組細(xì)胞的凋亡情況，得出MHCC97細(xì)胞的最佳熱療時(shí)間。根據(jù)此結(jié)果，進(jìn)行多次熱作用，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)的改變。Western-blot法分別檢測(cè)單次和多次熱作用后細(xì)胞NDRG2和HSP70蛋白的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理，進(jìn)行析因設(shè)計(jì)方差分析，兩兩比較使用t檢驗(yàn)，與對(duì)照組比較，P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　1.熱作用對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響
　　對(duì)照組細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好，多角形，細(xì)胞

5、邊界清晰、透明，細(xì)胞連接成片，數(shù)量較多。經(jīng)過(guò)不同時(shí)間的43℃熱處理后，各實(shí)驗(yàn)組MHCC97細(xì)胞的形態(tài)均發(fā)生不同程度改變，出現(xiàn)體積縮小、細(xì)胞皺縮，變梭形，部分細(xì)胞脫落等。以加熱2h后培養(yǎng)24h時(shí)細(xì)胞形態(tài)改變最明顯。
　　2.熱作用對(duì)細(xì)胞增殖的影響
　　43℃加熱后，各實(shí)驗(yàn)組MHCC97細(xì)胞均受到不同程度的增殖抑制，以加熱1h且培養(yǎng)24h后最為明顯（抑制率為67.1％）。與單次加熱比較，多次加熱后細(xì)胞增殖抑制率有明顯升高（抑制率

6、89％）。
　　3.熱作用對(duì)細(xì)胞凋亡的影響
　　應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肝癌細(xì)胞MHCC97熱作用后的凋亡情況，結(jié)果顯示：?jiǎn)未渭訜峥梢允辜?xì)胞凋亡率升高，并且隨著熱處理時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率也隨之升高；實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞凋亡率隨著加熱后培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，于加熱后培養(yǎng)時(shí)間為12h時(shí)達(dá)到高峰（各組凋亡率分別為2.7％、8.9％、23.3％、39.8％、57.5％），隨后開始出現(xiàn)降低趨勢(shì)；MHCC97細(xì)胞凋亡率在加熱2h后培養(yǎng)12h時(shí)達(dá)到最

7、大值（凋亡率為57.5％）；與單次熱作用相比，經(jīng)多次熱作用后，細(xì)胞凋亡率有所升高，以間隔48h再次加熱后培養(yǎng)24h時(shí)最高（凋亡率27.4％）。
　　4.熱作用對(duì)細(xì)胞NDRG2蛋白表達(dá)的影響
　　單次熱作用（43℃）能夠降低MHCC97細(xì)胞中NDRG2蛋白的表達(dá)，加熱后各組的NDRG2蛋白表達(dá)量低于對(duì)照組。在不同加熱時(shí)間的各實(shí)驗(yàn)組中，以加熱1h后的NDRG2蛋白表達(dá)量下降的最明顯；在相同加熱時(shí)間的各實(shí)驗(yàn)組中，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組各自進(jìn)行

8、比較，隨著加熱后培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，早期NDRG2蛋白表達(dá)略有下降，12-24h時(shí)降低最顯著。經(jīng)多次熱作用后， MHCC97細(xì)胞中NDRG2蛋白表達(dá)量有所降低，但是各實(shí)驗(yàn)組之間未見明顯差異。
　　5.熱作用對(duì)細(xì)胞HSP70蛋白表達(dá)的影響
　　單次熱作用后（43℃），MHCC97細(xì)胞中HSP70蛋白的表達(dá)逐漸升高，以加熱2h后24h升高最顯著。多次熱作用后，HSP70蛋白表達(dá)亦升高，以間隔48h再次加熱后升高最為顯著。
　　

9、結(jié)論：
　　1.單次熱作用（43℃）對(duì)人肝癌細(xì)胞株MHCC97具有殺傷和抑制增殖作用，并能夠誘導(dǎo)其凋亡，發(fā)生G1期阻滯，同時(shí)降低NDRG2蛋白的表達(dá)，且使HSP70蛋白升高。
　　2.多次熱作用能夠?qū)HCC97細(xì)胞產(chǎn)生更強(qiáng)的殺傷作用。NDRG2在多次熱作用后無(wú)明顯變化趨勢(shì)。HSP70蛋白的表達(dá)在熱作用后升高，以間隔48h再次加熱組升高最明顯。
　　3.NDRG2可能具有細(xì)胞保護(hù)作用，并且可能間接參與細(xì)胞熱應(yīng)激反應(yīng)。<