長(zhǎng)鏈非編碼RNA GHET1對(duì)人胃癌細(xì)胞MGC803生物學(xué)性狀的影響.pdf

1、目的：
　　檢測(cè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA GHET1（long non-coding RNA gastric carcinoma high expressed transcript1，lncRNA GHET1）在胃癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)情況，探索其在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用，探討其可否作為檢測(cè)和治療胃癌的潛在分子靶標(biāo)。
　　方法:
　?。?）收集35例胃癌組織及癌旁組織，采用實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitativ

2、e real-time polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測(cè)胃癌組織和癌旁組織中GHET1的表達(dá)，結(jié)合臨床資料分析GHET1與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。
　?。?）檢測(cè)人胃癌細(xì)胞株AGS, SGC-7901, BGC-823,MGC803,HGC-27細(xì)胞和正常胃粘膜細(xì)胞株GES-1中GHET1的表達(dá)，篩選體外沉默GHET1基因合適的胃癌細(xì)胞模型。
　?。?）設(shè)計(jì)針對(duì) GHET1的特異性序

3、列siRNA（small interference double-stranded RNA,siRNA）4條，非特異性siRNA陰性序列1條、陽性干擾甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)序列、陰性標(biāo)記羧基熒光素（FAM）序列各1條；實(shí)驗(yàn)分為空白組(control)、陰性對(duì)照組（si-NC）、陽性對(duì)照組（si-GAPDH）、陰性熒光標(biāo)記組（si-FAM）和GHET1沉默組（si-GHET1）5組。運(yùn)用倒臵熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。采用實(shí)時(shí)熒

4、光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)驗(yàn)證siRNA干擾后GHET1的表達(dá)情況，比較4條siRNA的抑制率，篩選出一條最佳的干擾序列。
　?。?）應(yīng)用干擾效率最佳的GHET1-siRNA轉(zhuǎn)染篩選出來的胃癌細(xì)胞株。運(yùn)用CCK8法檢測(cè)降低GHET1表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞增殖及5-氟尿嘧啶（5-Fluorouracil，5-Fu）敏感性的影響；流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞周期與凋亡變化；Hoechst33342染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)影響

5、；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)以及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。最后Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡及周期相關(guān)蛋白caspase3、PARP、Bcl-2、PCNA、CDK2、CDK4、pRB表達(dá)的改變。
　　結(jié)果：
　　（1）qRT-PCR檢測(cè) GHET1在胃癌組織中表達(dá)增高（P<0.01），且與胃癌的侵襲和TNM分期相關(guān)(P<0.01)；
　?。?）在分化程度不同的人胃癌細(xì)胞株中，GHET1基因表達(dá)不同程度的上

6、調(diào)，其中以MGC803表達(dá)上調(diào)(4.39〒0.75)最為顯著(P<0.01)。
　?。?）當(dāng)轉(zhuǎn)染熒光效率高于80％，qRT-PCR結(jié)果顯示si-GHET1-01的干擾效果最好干擾效率為（51.86〒6.99）%(P<0.001)。
　?。?）CCK-8結(jié)果顯示，MGC803細(xì)胞中 GHET1的表達(dá)下調(diào)可抑制細(xì)胞增殖(P<0.05)，但不能增加細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性(P>0.05)。
　?。?）細(xì)胞周期結(jié)果顯示,沉默 G

7、HET1細(xì)胞 G0/G1期比例升高，S期的比例降低(P<0.01)。
　?。?）細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示，si-GHET1組細(xì)胞凋亡率無顯著性改變，(P>0.05)。
　?。?）Hoechst33342染色結(jié)果顯示，沉默GHET1對(duì)細(xì)胞凋亡的形態(tài)影響無差異性，結(jié)果與流式結(jié)果一致。
　　（8）細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，沉默GHET1細(xì)胞愈合能力顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。
　?。?）Transwell小室侵襲、遷

8、移實(shí)驗(yàn)顯示，沉默GHET1侵襲和遷移地細(xì)胞穿過膜的數(shù)目顯著降低，差異有顯著性(P<0.05)。
　?。?0）Western blot檢測(cè)細(xì)胞凋亡及增殖相關(guān)蛋白，與空白組及陰性對(duì)照組相比， si-GHET1組caspase3、PARP、Bcl-2的蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。PCNA、CDK2、CDK4、pRB的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　?。?）GHET1基因在