信號通路與腫瘤發(fā)生

1、細胞信號傳導(dǎo)與腫瘤發(fā)生,腫瘤的發(fā)生,腫瘤的分類,1976年，J. M. Bishop和H. E. Varmus發(fā)現(xiàn)宿主細胞基因組內(nèi)含有與鳥類Rous肉瘤病毒高度同源的src 基因，并首次提出細胞癌基因（cellular oncogene,c-onc），從而分享了1989年的諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。,Harold E. Varmus,J Michael Bishop,歷史,信號通路（signal pathway）的提出最早可以追溯到1972年，

2、不過那時被稱為信號轉(zhuǎn)換（signal transmission）。1980年，M. Rodbell在一篇綜述中提到信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction），此后這個概念就被廣泛使用了。,細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本過程,信號分子,接收器,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,靶細胞效應(yīng),慢反應(yīng)激活轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶基因表達,快反應(yīng)調(diào)節(jié)效應(yīng)蛋白的活性（代謝酶、離子通道等）,信號分子(ligand),化學(xué)信號：激素、神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽、局部體液因子、細

3、胞的代謝物、外源性的藥物或毒物物理信號：光、電、機械刺激、細胞之間和細胞與細胞外基質(zhì)間的直接接觸氣體信號：NO、CO脂溶性: 類固醇激素，甲狀腺激素水溶性：生長因子等肽類激素,,接收器 (receiver),受體 (receptor) 細胞膜上或細胞內(nèi)能識別生物活性分子并與之結(jié)合的成分，它能把識別和接受的信號正確無誤地放大并傳遞到細胞內(nèi)部，進而引起生物學(xué)效應(yīng)能接受信號的其它成分,本世紀(jì)初

4、“受體”概念----1955年正式確立,1951年 發(fā)現(xiàn)NGF 1960年 發(fā)現(xiàn)EGF 1986年 諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎1957年 第二信使cAMP發(fā)現(xiàn)并提出 1971年 諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎1957年 蛋白磷酸化的發(fā)現(xiàn)及分離 1992年 諾貝爾生理與醫(yī)學(xué)獎20世紀(jì)70年代 G蛋白發(fā)現(xiàn)和克隆 1994年 諾貝爾生理

5、與醫(yī)學(xué)獎20世紀(jì)90年代 細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的網(wǎng)絡(luò)研究初見雛形并日趨完善NO—偉哥1997年美國信息研究所“熱點科學(xué)研究”論文統(tǒng)計：科研項目排行第一,(一) 受體,膜受體(membrane receptor)存在于細胞膜上能與胞外信息分子結(jié)合，并將信號傳遞至胞漿或核內(nèi)，調(diào)節(jié)靶細胞功能的分子核受體(nuclear receptor)位于胞漿或核內(nèi)的受體，激活后作為轉(zhuǎn)錄因子，在核內(nèi)調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，從而誘發(fā)細胞特

6、定的應(yīng)答反應(yīng),膜受體,G蛋白偶聯(lián)受體受體酪氨酸激酶家族細胞因子受體超家族絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶型受體家族死亡受體家族離子通道型受體粘附分子受體,，,核受體,甾體激素受體超家族非甾體激素受體超家族 甲狀腺激素受體維甲酸受體維生素D3受體家族,(二) 能接受信號的其它成分,粘附分子（如鈣粘素、整合素）離子通道免疫球蛋白選擇素,概念,信號通路是指能將細胞外的分子信號經(jīng)細胞膜傳入細胞內(nèi)發(fā)揮效應(yīng)的一系列酶促反應(yīng)

7、通路。這些細胞外的分子信號（稱為配體，ligand）包括激素、生長因子、細胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)以及其它小分子化合物等。當(dāng)配體特異性地結(jié)合到細胞膜或細胞內(nèi)的受體（receptor）后，在細胞內(nèi)的信號傳遞。,特點1.蛋白磷酸化,各個信號通路中上游蛋白對下游蛋白活性的調(diào)節(jié)（包括激活或抑制作用）主要是通過添加或去除磷酸基團，從而改變下游蛋白的立體構(gòu)象完成的。所以，構(gòu)成信號通路的主要成員是蛋白激酶和磷酸酶，它們能夠快速改變和恢復(fù)下游蛋白的構(gòu)象。,,1

8、992年諾貝爾生理或醫(yī)學(xué)獎授予給了Edmond Fischer 和 Edwin Krebs"for their discoveries concerning reversible protein phosphorylation as a biological regulatory mechanism",特點2. 級聯(lián)放大,從細胞受體接收外界信號到最后做出綜合性應(yīng)答，不僅是一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，更重要的是將外界信號進行逐

9、步放大的過程。受體蛋白將細胞外信號轉(zhuǎn)變?yōu)榧毎麅?nèi)信號，經(jīng)信號級聯(lián)放大、分散和調(diào)節(jié)，最終產(chǎn)生一系列綜合性的細胞應(yīng)答，包括下游基因表達的調(diào)節(jié)、細胞內(nèi)酶活性的變化、細胞骨架構(gòu)型和DNA合成的改變等,信號放大的定義,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程所產(chǎn)生的最終靶物質(zhì)的濃度遠遠高于輸入信號所能達致水平的現(xiàn)象。這是由于輸入的信號通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)被逐級放大，并生成對靶物質(zhì)的產(chǎn)生起作用的酶或效應(yīng)物所造成的結(jié)果。常見于G蛋白介導(dǎo)的信號通路。信號的過度放大可能非常有害，因此

10、細胞通過抑制性受體或誘餌受體等對其進行控制。,,,信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與細胞應(yīng)答模式,,JAK-STAT5信號通路,JAK-STAT信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的一條由細胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程。與其它信號通路相比，這條信號通路的傳遞過程相對簡單，它主要由三個成分組成，即酪氨酸激酶相關(guān)受體酪氨酸激酶JAK轉(zhuǎn)錄因子STAT。,① 酪氨酸激酶相關(guān)受體（tyrosine kinase assoc

11、iated receptor）,許多細胞因子和生長因子通過JAK-STAT信號通路來傳導(dǎo)信號，這些細胞因子和生長因子在細胞膜上有相應(yīng)的受體。這包括白介素2~7（IL-2~7）、GM-CSF（粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子）、GH（生長激素）、EGF（表皮生長因子）、PDGF （血小板衍生因子）IFN（干擾素）等等。,共同點,這些受體的共同特點是受體本身不具有激酶活性胞內(nèi)段具有酪氨酸激酶JAK的結(jié)合位點。受體與配體結(jié)合后，

12、通過與之相結(jié)合的JAK的活化，來磷酸化各種靶蛋白的酪氨酸殘基以實現(xiàn)信號從胞外到胞內(nèi)的轉(zhuǎn)遞。,② 酪氨酸激酶JAK（Janus kinase）,Janus在羅馬神話中是掌管開始和終結(jié)的兩面神。之所以稱為兩面神激酶，是因為JAK既能磷酸化與其相結(jié)合的細胞因子受體，又能磷酸化多個含特定SH2結(jié)構(gòu)域的信號分子。,,JAK蛋白家族共包括4個成員：JAK1、JAK2、JAK3以及Tyk2，它們在結(jié)構(gòu)上有7個JAK同源結(jié)構(gòu)域（JAK homology

13、domain, JH），其中JH1結(jié)構(gòu)域為激酶區(qū)、JH2結(jié)構(gòu)域是“假”激酶區(qū)、JH6和JH7是受體結(jié)合區(qū)域,③ 轉(zhuǎn)錄因子STAT（signal transducer and activator of transcription）,STAT被稱為“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子”。顧名思義，STAT在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活上發(fā)揮了關(guān)鍵性的作用。目前已發(fā)現(xiàn)STAT家族的六個成員，即STAT1-STAT6。,,STAT蛋白在結(jié)構(gòu)上可分為以下幾個功能區(qū)段：

14、N-端保守序列、DNA結(jié)合區(qū)SH3結(jié)構(gòu)域、SH2結(jié)構(gòu)域C-端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)。其中，序列上最保守和功能上最重要的區(qū)段是SH2結(jié)構(gòu)域，它具有與酪氨酸激酶Src的SH2結(jié)構(gòu)域完全相同的核心序列“GTFLLRFSS”,細胞因子與相應(yīng)的受體結(jié)合后引起受體分子的二聚化，這使得與受體偶聯(lián)的JAK激酶相互接近并通過交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受體上的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化修飾，繼而這些磷酸化的酪氨酸位點與周圍的氨基酸序列形

15、成“停泊位點”（docking site），同時含有SH2結(jié)構(gòu)域的STAT蛋白被招募到這個“停泊位點”。最后，激酶JAK催化結(jié)合在受體上的STAT蛋白發(fā)生磷酸化修飾，活化的STAT蛋白以二聚體的形式進入細胞核內(nèi)與靶基因結(jié)合，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄,3) JAK-STAT信號通路與白血病,JAK-STAT信號通路功能廣泛，目前許多研究都集中于免疫反應(yīng)與免疫調(diào)控。結(jié)合最新一期《癌細胞》（Cancer Cell ）雜志刊登有關(guān)STAT5信號與白血病

16、JMML的關(guān)系，下面我們將著重介紹JAKSTAT信號通路與白血病的發(fā)病機制。,,白血病是造血組織的惡性疾病， 又稱“血癌”，是我國最常見的惡性腫瘤之一。該病居年輕人所患惡性疾病中的首位。與正常的造血細胞相比，白血病細胞表現(xiàn)出截然相反的生物學(xué)特性。正常造血細胞在細胞因子的作用下不斷分化成熟，而白血病細胞則表現(xiàn)為分化過程受阻，進而無限制地增殖，這提示細胞內(nèi)信號通路的異常在白血病形成中起著重要的作用。,,在白血病細胞中普遍存在著JAK-STA

17、T信號通路的持續(xù)激活，因此，STAT蛋白也就成為重點檢測的指標(biāo)之一。STAT分子的過量表達往往出現(xiàn)在很多惡性增殖性疾病中，而造血系統(tǒng)的腫瘤（包括白血病和淋巴瘤）中STAT家族被活化的種類最多，例如STAT1、STAT3和STAT5就是白血病中最常見的持續(xù)激活的信號蛋白。,,我們已經(jīng)在人體白血病細胞中發(fā)現(xiàn)了很多JAK 基因的點突變，其中的一些點突變造成激酶JAK持續(xù)激活STAT蛋白。最典型的例子就是JAK2V617F突變（蛋白JAK2第6

18、17位的纈氨酸突變成苯丙氨酸）造成JAK-STAT信號通路的異常激活。,p53信號通路,p53 基因受多種信號因子的調(diào)控。例如：當(dāng)細胞中的DNA損傷或細胞增殖異常時，p53 基因被激活，導(dǎo)致細胞周期停滯并啟動DNA修復(fù)機制，使損傷的DNA得以修復(fù),酵母雙雜交系統(tǒng),將待研究的兩種蛋白質(zhì)的基因分別克隆到酵母表達質(zhì)粒的轉(zhuǎn)錄激活因子(如GAL4等)的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域基因和GAL4激活結(jié)構(gòu)域基因，構(gòu)建成融合表達載體，從表達產(chǎn)物分析兩種蛋白質(zhì)相互作

19、用的系統(tǒng)。,,雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調(diào)控轉(zhuǎn)錄起始過程的認識。 細胞起始基因轉(zhuǎn)錄需要有反式轉(zhuǎn)錄激活因子的參與。 80年代的工作表明, 轉(zhuǎn)錄激活因子在結(jié)構(gòu)上是組件式的(modular), 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結(jié)構(gòu)域構(gòu)成, 其中有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DNA binding domain, 簡稱為DB)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, 簡稱為AD), 它們是轉(zhuǎn)錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。 單獨的

20、DB雖然能和啟動子結(jié)合, 但是不能激活轉(zhuǎn)錄。 而不同轉(zhuǎn)錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白仍然具有正常的激活轉(zhuǎn)錄的功能。,,,,MDM2是一種特異性針對p53的泛素化E3連接酶，它可直接與p53蛋白結(jié)合來促進p53蛋白的泛素化降解，并在細胞內(nèi)p53蛋白動態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵的作用。MDM2本身也可被p53蛋白激活，因此MDM2是p53通路中重要的負反饋調(diào)節(jié)因子（negative feedback regulator）,,,,目前看來，在腫瘤

21、形成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)和調(diào)控體系中，p53是最主要的因素。有人認為p53是很好的腫瘤診斷標(biāo)志物，可以作為癌癥早期診斷的重要指標(biāo)。認識到p53 基因的重要作用后，全世界數(shù)以千計的分子生物學(xué)家正在拋開原來的課題轉(zhuǎn)而研究p53，希望以此作為攻克癌癥的突破口?？茖W(xué)家相信，利用p53 基因發(fā)現(xiàn)并治療癌癥的前景非常廣闊。除了基因治療，研究人員正在篩選可以影響p53 基因上下游調(diào)控的小分子化合物。羅氏制藥公司開發(fā)的一種名為nutlins的小分子化合物，能

22、夠干擾p53和MDM2之間的調(diào)控關(guān)系，有望成為一種有效的抗癌藥物。,針對P53的治療,其中美國Introgen Therapeutics公司曾經(jīng)在1996年得到過非常好的臨床實驗結(jié)果。 直到2004年，使用腺病毒載體治療頭頸部腫瘤的p53基因療法才在中國獲得批準(zhǔn)，這也是迄今為止第一個獲批的能夠常規(guī)用于人體臨床治療的基因治療方法。但是我們?nèi)匀恍枰獣r間對這種療法做出最終的抉擇。眾多的患者和科學(xué)家也都在熱切期盼Introgen Ther

23、apeutics公司開發(fā)的新型腺病毒p53基因治療產(chǎn)品Advexin的III期臨床實驗結(jié)果。,腺病毒載體,腺病毒載體轉(zhuǎn)基因效率高，體外實驗通常接近100％的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率；可轉(zhuǎn)導(dǎo)不同類型的人組織細胞，不受靶細胞是否為分裂細胞所限；容易制得高滴度病毒載體，在細胞培養(yǎng)物中重組病毒滴度可達（10E＋11）/ml；進入細胞內(nèi)并不整合到宿主細胞基因組，僅瞬間表達，安全性高。因而，腺病毒載體在基因治療臨床試驗方面有了越來越多的應(yīng)用，成為繼逆轉(zhuǎn)錄病毒載體之

24、后廣泛應(yīng)用且最具前景的病毒載體。,,典型的腺病毒載體系統(tǒng)如：穿梭質(zhì)粒pCA13/腺病毒基因組質(zhì)粒pBHG11/包裝細胞293細胞。pCA13表達盒的插入使腺病毒E1基因缺失；pBHG11則保留了腺病毒基因組的絕大部分，但是缺失E1區(qū)及其他區(qū)域293細胞是整合有Ad5 E1基因的人胚腎細胞系。pBHG11因為缺失包裝信號及E1區(qū)而不能復(fù)制，pCA13帶有包裝信號及E1的側(cè)翼序列，但是缺失E1區(qū)及腺病毒絕大部分基因組，同樣不能復(fù)制

25、。外源目的基因插入pCA13后，與pBHG11共轉(zhuǎn)染，進入293細胞。pCA13與pBHG11在細胞內(nèi)發(fā)生同源重組，同時，293細胞提供E1蛋白，從而包裝產(chǎn)生腺病毒顆粒。該病毒的蛋白質(zhì)外殼同野生型腺病毒相似，具有同樣的感染力進入靶細胞的能力，但是基因組DNA的E1區(qū)被外源目的基因取代，即進入靶細胞后病毒不能復(fù)制，但可以表達目的蛋白。,3 NF- κB信號,1975年，E. A. Carswell和L. J. Old等人發(fā)現(xiàn)已接種卡介苗的

26、小鼠注射脂多糖后，小鼠血清中產(chǎn)生了一種可引起動物腫瘤組織出血壞死的物質(zhì)，該物質(zhì)對體外培養(yǎng)的多種腫瘤細胞株都具有細胞殺傷作用，于是他們將這種物質(zhì)命名為腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor, TNF）。TNF是迄今發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤效果最強的細胞因子。,,TNF是一種糖蛋白，它以兩種形式存在：TNF-α和TNF-β。TNF-α由單核細胞和巨噬細胞產(chǎn)生，它可引起腫瘤組織出血壞死，而脂多糖Lipopolysaccharides

27、, LPS）是較強的刺激劑。TNF-β是一種淋巴因子，又稱淋巴毒素（lymphotoxin, LT）。抗原或絲裂原均可刺激T淋巴細胞分泌TNF-β，具有腫瘤殺傷及免疫調(diào)節(jié)功能。,,人的TNF-α 基因長2.76 kb，由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成，定位在第六號染色體上。人TNF-α前體由233個氨基酸組成，含有76個氨基酸殘基的信號肽切除信號肽后形成157個氨基酸的成熟型非糖基化的TNF-α。通過基因工程方法改造后的TNF-α具有更