胃癌外泌體miRNA表達差異性研究.pdf

1、研究目的：
　　檢測臨床胃癌病人血清外泌體miRNA(Serum Exosomal microRNAs)表達譜，比較Exosome在不同分期胃癌中的分子差異，在此基礎上，評估血清外泌體miRNA作為診斷標志物的意義，探討利用Exosome分子特征評估胃癌患者的轉移潛能的作用，進一步分析特異血清外泌體miRNA水平與腫瘤生物學行為及臨床特點間的關系。
　　研究方法：
　　(1)病例選擇:依據實驗設計要求的納入及排除標準，

2、選取2016年3月1日起的長海醫(yī)院胃腸外科收治的胃癌患者。(2)標本采樣:于術前晨6時用采血針和分離膠促凝管抽取外周血，使用離心機分離血清(2ml)，-80℃凍存，干冰運輸。(3)樣本檢測:使用RiboTM Exosome Isolation Reagent for plasma or serum分離血清外泌體。采用Magen試劑盒進行樣品抽提，并用Agilent2200TapeStation和ND-1000Nanodrop進行樣品質檢

3、，A260:A280＞1.8，A260:A230＞2.2為質檢通過的樣品。(4)建立文庫:質檢通過的樣品，以1ug起始量，用TruSeq(@)Small RNA Sample Prep Kit進行文庫構建，并用Agilent2200TapeStation進行文庫質檢，片段平均長度140-170bp為質檢通過的文庫。(5)上機測序:通過質檢的文庫，按照HiSeq2500User Guide中所述的方法進行上機樣本制備，上機樣本的終濃度為1

4、0pM。使用Single Read Flow Cell，按照HiSeq2500User Guide的指示進行HiSeq2500上機操作，并運行single-end(1×50)標準測序程序。(6)數據分析:測序程序運行完畢，對所得數據進行生物信息學分析，建立exsomal miRNA表達譜。使用SPSS18.0軟件中t檢驗或方差方法分析exosome總量及不同miRNA表達差異與腫瘤臨床特點間的關系。根據臨床特點分組后，使用PCA分析、D

5、Eseq、EdgeR方法確定差異表達miRNA，使用GO及KEGG對其靶基因進行富集分析。
　　研究結果：
　　PCA分析發(fā)現淋巴結分組及TNM分期分組與樣本中已知miRNA表達水平不想關。結合PCA方法重新分組，對比4例晚期及5例早期病例，發(fā)現55個差異表達的miRNA，DEseq方法發(fā)現39個差異表達miRNA，EdgeR發(fā)現52個差異表達miRNA，其中36個為重疊miRNA。靶基因GO分析結果顯示靶基因富集于mRNA