MiR-422a在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者外周血單核細胞中的表達和功能.pdf

1、目的:
　　鑒于外周血單核細胞與骨質(zhì)疏松關(guān)系密切，在本研究小組之前已首次報道m(xù)iR-133a是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥外周血單核細胞中潛在的生物學(xué)標志物的基礎(chǔ)上，本研究采用微矩陣基因芯片等一系列生物學(xué)方法進一步探討絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者外周血單核細胞中micoRNA表達譜，尋找可能的生物標志物及其靶基因，并初步觀察其生物學(xué)功能。
　　材料與方法:
　　1.本研究招募相互匹配的20例白種人絕經(jīng)后女性，依據(jù)骨密度值分為低骨密度和高骨

2、密度組各10例。抽取外周靜脈全血，采用密度梯度離心的方法，初步分離獲得外周血單個核細胞，緊接著借助抗原抗體結(jié)合免疫磁珠法篩選出未接觸表面抗體的外周血單核細胞，流式細胞儀檢測外周血單核細胞純度，應(yīng)用miRNA array芯片技術(shù)，分析獲得miRNA差異表達譜，選取差異表達的miRNAs，進一步行逆轉(zhuǎn)錄后實時熒光定量PCR驗證，得出差異表達基因miR-422a。同時，采用大致相同的方法檢測來自相同外周血單個核細胞樣本中B淋巴細胞的miR-4

3、22a在低骨密度組和高骨密度組的表達水平。
　　2.運用生物信息學(xué)方法篩選miR-422a潛在的靶基因，對篩查出的5個潛在靶基因CBL、CD226、IGF-1、PAG1、TOB2運用實時熒光定量PCR檢測其實際表達水平，分析與miR-422a表達水平的相互關(guān)系。
　　3.利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染成熟miR-422a的模擬物或抑制物到正常人外周血單核細胞，初步觀察miR-422a在外周血單核細胞誘導(dǎo)分化為破骨樣細胞過程中發(fā)揮的作用。

4、r>　　結(jié)果:
　　1.絕經(jīng)后女性高密度組，腰椎骨密度值為（1.128±0.058）g/cm2，腰椎Z值為（2.24±0.59），髖部骨密度值為（1.057±0.101）g/cm2，髖部Z值為(1.94±0.99)。低密度組腰椎骨密度值為（0.826±0.069）g/cm2，腰椎Z值為（-0.63±0.64），髖部骨密度值為（0.725±0.045）g/cm2，髖部Z值為（-1.04±0.45）。髖部和脊柱骨密度和Z值在高骨密度和

5、低骨密度組之間差異顯著(P＜0.001)。MicroRNA矩陣列分析，對兩組20例單核細胞RNA樣本中365個miRNA的表達水平測試發(fā)現(xiàn):miR-133a、miR-382差異表達明顯，miR-422a、mir-27b、miR-151、miR-152呈統(tǒng)計學(xué)臨界差異表達水平，且在20例樣本中均檢測到表達，具體為:miR-133a的表達水平在低骨密度組相比高骨密度組有6.48倍的上調(diào)（4.21±2.15 vs.0.65±0.75，P=0.

6、007）， miR-382的表達水平在低骨密度組相比高骨密度組有3.65倍的上調(diào)（2.74±2.18對比0.75±0.63，P=0.027）。此外，還有四個臨界差異表達的miRNA分子:miR-422a的（2.91±2.55 vs.1.24±0.79,P=0.065）、miR-27b(2.48±2.05 vs.1.02±0.86,P=0.054)、miR-151(1.44±0.87 vs.0.86±0.42,P=0.076)和miR-1

7、52(1.32±0.49 vs.0.91±0.47,P=0.076)。在本研究小組之前已經(jīng)驗證miR-133a和miR-382的基礎(chǔ)上，繼續(xù)運用實時熒光定量PCR分別對在矩陣列分析中四個臨界差異表達的miRNA分子進一步驗證。結(jié)果顯示:僅miR-422a的表達水平在低骨密度組和高骨密度組之間具有統(tǒng)計學(xué)差異(1.31±0.54 vs.0.85±0.27，P=0.029)。其他三個miRNA分子的表達水平在低骨密度組和高骨密度組之間無統(tǒng)計學(xué)

8、差異。具體結(jié)果為:miR-27b(1.26±0.66 vs.0.99±0.43,P=0.29)、miR-151(1.37±1.08 vs.0.98±0.41,P=0.30)和miR-152(1.50±1.11 vs.0.95±0.54，P=0.17)。外周血B淋巴細胞中miR-422a的表達水平在低骨密度組和高骨密度組之間無統(tǒng)計學(xué)差異(P=0.31)。
　　2.借助生物信息學(xué)工具，篩選出CBL、CD226、IGF1、PAG1和TO

9、B2等5個潛在靶基因。RT-qPCR檢測顯示這5個基因在絕經(jīng)后女性外周血單核細胞中的表達在低骨密度組與高骨密度組之間沒有統(tǒng)計學(xué)差異，具體為:CBL(4.82±5.43 vs.2.62±3.27，P=0.29)、CD226(2.79±5.40 vs.2.29±3.72，P=0.81)、 IGF1(1.22±1.39 vs.4.92±6.78，P=0.11)、PAG1(2.65±3.78 vs.2.88±5.43，P=0.92)和TOB2(

10、1.37±2.44 vs.4.96±7.99，P=0.19)。miR-422a的與這五個潛在靶基因之間的相關(guān)性分析表明:盡管相關(guān)性檢驗沒有差異，但是這5個基因和miR-422a的之間均存在負相關(guān)性(P＞0.05)。
　　3.在單核細胞向破骨樣細胞誘導(dǎo)分化的基礎(chǔ)上，轉(zhuǎn)染引入成熟miR-422a的模擬物或抑制物，依據(jù)干預(yù)因素的不同，分為6組，A組（空白對照組）、B組（誘導(dǎo)分化組）、C組（誘導(dǎo)分化+ miRNA模擬物陰性對照組）、D組（

11、誘導(dǎo)分化+ miRNA模擬物組）、E組（誘導(dǎo)分化+ miRNA抑制物陰性對照組）、F組（誘導(dǎo)分化+miRNA抑制物組）。培養(yǎng)至第8天，光學(xué)顯微鏡下觀察細胞誘導(dǎo)分化情況，發(fā)現(xiàn)各組結(jié)果如下:A組（空白對照組）未見破骨樣細胞生成;B組（誘導(dǎo)分化組）有一定數(shù)量的破骨樣細胞;C組（誘導(dǎo)分化+ miRNA模擬物陰性對照組）也可見破骨樣細胞生成，其數(shù)量與B組相比無統(tǒng)計學(xué)差異;D組（誘導(dǎo)分化+ miRNA模擬物組）可見破骨樣細胞生成，其數(shù)量與C組（誘導(dǎo)

12、分化+ miRNA模擬物陰性對照組）相比明顯增加，統(tǒng)計學(xué)差異顯著;E組（誘導(dǎo)分化+ miRNA抑制物陰性對照組）也可見破骨樣細胞生成，其數(shù)量與B組（誘導(dǎo)分化組）相比無統(tǒng)計學(xué)差異;F組（誘導(dǎo)分化+ miRNA抑制物組）可見破骨樣細胞生成，其數(shù)量與E組（誘導(dǎo)分化+ miRNA抑制物陰性對照組）相比明顯減少，統(tǒng)計學(xué)差異顯著。
　　結(jié)論:
　　1.miR-422a是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥一種潛在的外周血單核細胞特異性生物標志物，在絕經(jīng)后骨