單核細(xì)胞在外周血干細(xì)胞移植治療終末期肝病中的作用及其機(jī)制探討.pdf

1、粒細(xì)胞集落刺激因子（Granulocytecolony-stimulatingfactor,G-CSF）動員的外周血干細(xì)胞（Peripheralbloodstemcells,PBSCs）移植，可導(dǎo)致血循環(huán)中中性粒細(xì)胞及血小板迅速增加，已成為造血干細(xì)胞移植的重要方法。然而，新近研究發(fā)現(xiàn)，PBSCs可向多種組織細(xì)胞分化，其在終末期肝病等多種損傷組織的修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用。動物實(shí)驗(yàn)表明，G-CSF可促進(jìn)骨髓干細(xì)胞向損傷肝臟遷移，誘發(fā)內(nèi)源性

2、肝細(xì)胞再生。臨床研究也證實(shí)，G-CSF動員或PBSCs移植均可有效改善終末期肝病患者的肝功能。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，自體PBSCs經(jīng)肝動脈回輸可提高乙肝相關(guān)性終末期肝病患者的白蛋白（Albumin,ALB）水平和CTP（Child-Turcotte-Pugh）評分。然而，PBSCs中存在著多個亞群的干細(xì)胞，是哪一亞群的細(xì)胞在此過程中發(fā)揮了作用，尚不清楚。
　　傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，外周血中的單核細(xì)胞是吞噬細(xì)胞的前體細(xì)胞，可定向分化為巨噬細(xì)

3、胞和樹突狀細(xì)胞。近年來研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)中的單核細(xì)胞具有多向分化的潛能，可誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞、骨、心肌、神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等多種組織細(xì)胞。本課題組前期研究也證實(shí)，PBSCs中的單核細(xì)胞具有干細(xì)胞的潛能，可誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣的細(xì)胞。另外，多項(xiàng)研究顯示，循環(huán)中的單核細(xì)胞可能是肝硬化逆轉(zhuǎn)的重要調(diào)節(jié)細(xì)胞。單核細(xì)胞功能敲除的小鼠，可延緩四氯化碳（Carbontetrachloride，CCl4）誘導(dǎo)的肝纖維化降解的進(jìn)程。同時，在損傷的肝臟，巨噬細(xì)胞可分

4、泌腫瘤壞死因子相關(guān)調(diào)亡誘導(dǎo)配體（TNF-relatedapoptosis-inducingligand，TRAIL），進(jìn)而激活活化星形細(xì)胞（Hepaticstellatecells，HSCs）上的死亡受體，誘導(dǎo)其調(diào)亡。
　　然而，單核細(xì)胞是否為PBSCs移植治療終末期肝病真正的效應(yīng)細(xì)胞，在終末期肝病的干細(xì)胞治療中發(fā)揮了重要的作用，尚不清楚。
　　【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?br>　　1.檢測PBSCs中CD14+單核細(xì)胞亞群的干細(xì)胞潛能；

5、2.比較PBSCs中CD14+單核細(xì)胞和CD14-細(xì)胞移植對CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝硬化的治療作用；3.探討CD14+單核細(xì)胞參與損傷肝臟修復(fù)可能的機(jī)制。
　　【材料和方法】
　　1.利用G-CSF動員雄性大鼠的外周血干細(xì)胞，以Ficoll為介質(zhì)通過密度梯度離心法分離PBSCs；2.通過免疫磁珠分選PBSCs中CD14+單核細(xì)胞亞群；3.利用形態(tài)學(xué)、流式細(xì)胞儀和細(xì)胞化學(xué)等檢測，觀察CD14+單核細(xì)胞亞群的干細(xì)胞潛能；4.將CCl

6、4誘導(dǎo)的雌性肝硬化大鼠隨機(jī)分為兩組，每組30只，分別從門靜脈輸注CM-DiI染料標(biāo)記的CD14+單核細(xì)胞或CD14-細(xì)胞（1x107cells/rat）；5.通過生存分析、血清學(xué)和門靜脈壓力等檢測，對比CD14+單核細(xì)胞和CD14-細(xì)胞移植對大鼠肝硬化的治療效果；6.通過苦味酸天狼星紅染色、Masson三色染色、免疫組化和Real-timePCR等方法，檢測細(xì)胞移植對大鼠肝纖維化程度的影響；7.通過熒光示蹤和Y染色體原位末端標(biāo)記（Pri

7、medinsitulabeling，PRINS）技術(shù)，觀察移植的CD14+單核細(xì)胞在損傷肝臟的定植情況；8.通過激光共聚焦檢測，觀察損傷肝臟中定植細(xì)胞的性質(zhì)；9.通過免疫組化和Real-timePCR等方法，觀察單核細(xì)胞移植對肝細(xì)胞再生能力的影響；10.通過原位凝膠酶譜、凝膠酶譜、Westernblot、Real-timePCR和激光共聚焦等方法，探討單核細(xì)胞逆轉(zhuǎn)肝纖維化可能的機(jī)制。
　　【結(jié)果】
　　1.大鼠PBSCs中C

8、D14+單核細(xì)胞亞群的分離及干細(xì)胞潛能的鑒定
　　流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，我們分離的PBSCs中的單核細(xì)胞，單核細(xì)胞標(biāo)志物CD14和CD11b的表達(dá)率分別為95.4％±0.3％和93.7％±1.8％。該亞群的部分細(xì)胞可表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)志物CD34（1.1％±0.3％）、CD45（42.8％±4.6％），間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志物CD44（50.1％±4.3％）以及多能干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子Oct3/4（4.2％±1.1％）和Sox2（5.7％±1.

9、5％）。然而，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD133的表達(dá)則為陰性。另外，在塑料培養(yǎng)板上，該亞群細(xì)胞具有與單核細(xì)胞相似的良好的貼壁能力；在無外援性生長因子的作用下，RPMI1640培養(yǎng)3-5天后，其呈現(xiàn)出干細(xì)胞特有的集落生長能力。以上結(jié)果說明，PBSCs中CD14+單核細(xì)胞亞群具有干細(xì)胞潛能。
　　2.PBSCs中CD14+單核細(xì)胞和CD14-細(xì)胞對大鼠肝硬化治療效果的比較
　　將CCl4誘導(dǎo)的雌性肝硬化大鼠隨機(jī)分為兩組，每組30只，分別

10、從門靜脈輸注CD14+單核細(xì)胞或CD14-細(xì)胞。移植后4周，CD14+單核細(xì)胞移植組和CD14-細(xì)胞移植組大鼠血清中的ALT和AST水平較移植前均明顯減低。然而，相比CD14-細(xì)胞移植，CD14+單核細(xì)胞移植可有效提高大鼠血清中ALB水平和生存率，降低門靜脈壓力（p<0.01）。另外，通過天狼星紅染色、Masson三色染色和肝纖維化相關(guān)分子（FN、α-SMA和TGF-β）的檢測，我們發(fā)現(xiàn)CD14+單核細(xì)胞移植組大鼠的肝纖維化程度（2.1

11、％±0.9％）較CD14-細(xì)胞移植組（11.2％±2.3％）明顯減低（p<0.01）。Real-timePCR結(jié)果證實(shí)，移植后1周，CD14+單核細(xì)胞移植組大鼠肝組織中肝纖維化相關(guān)分子（FN,α2-(1)-procollagen,α-SMA和TGF-β）的mRNA表達(dá)較CD14-細(xì)胞移植組也明顯降低（p<0.01）。
　　3.單核細(xì)胞促進(jìn)損傷肝臟肝細(xì)胞再生的機(jī)制
　　利用熒光示蹤技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)CM-DiI染料標(biāo)記的單核細(xì)胞在

12、損傷肝臟中有定植，其主要分布于肝小葉的匯管區(qū)（86.9％±10.1％），少部分細(xì)胞位于肝實(shí)質(zhì)區(qū)內(nèi)（8.4％±2.5％）。PRINS結(jié)果也證實(shí)，移植的帶有Y染色體的單核細(xì)胞在雌性肝硬化模型鼠中確有定植。激光共聚焦結(jié)果顯示，這些定植的細(xì)胞中，僅有1.8％±0.4％的細(xì)胞具有肝細(xì)胞標(biāo)志物ALB和CK18的表達(dá)；另外，肝巨噬/Kuffer細(xì)胞標(biāo)志物F4/80的表達(dá)率為62.1％±9.8％，但肝干細(xì)胞標(biāo)志物OV6和纖維母細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)

13、為陰性。
　　免疫組化結(jié)果顯示，CD14+單核細(xì)胞移植組大鼠肝組織中肝細(xì)胞再生指數(shù)Ki-67的表達(dá)（移植后1周10.79％±2.98％，2周15.31％±3.24％）較CD14-細(xì)胞移植組（移植后1周6.16％±1.24％，2周8.45％±0.98％）明顯增加（p<0.01）。Real-timePCR結(jié)果證實(shí)，移植后1周，CD14+單核細(xì)胞移植組大鼠肝組織中肝細(xì)胞再生相關(guān)因子（HGF,TGF-α,EGF和VEGF）的mRNA表達(dá)，

14、較CD14-細(xì)胞移植組也明顯增高（p<0.01）。
　　4.單核細(xì)胞促進(jìn)肝硬化逆轉(zhuǎn)的機(jī)制
　　通過原位凝膠酶譜和凝膠酶譜檢測，我們發(fā)現(xiàn)：CD14+單核細(xì)胞移植組大鼠肝組織中MMP-2和-9的活性較CD14-細(xì)胞移植組明顯增強(qiáng)；同時單核細(xì)胞移植后2周，肝組織中MMP-2和-9的分泌活性最高。Westernblot結(jié)果顯示，在CD14+單核細(xì)胞移植組大鼠肝組織中，不僅有MMP-2和-9蛋白表達(dá)的增加，而且MMP-13的表達(dá)也是增

15、高的。Real-timePCR結(jié)果證實(shí)，移植后1周，相比CD14-細(xì)胞移植組，CD14+單核細(xì)胞移植組大鼠肝組織中MMP-2，-9和-13的mRNA表達(dá)增高；另外TIMP-1的mRNA表達(dá)降低（p<0.01）。激光共聚焦結(jié)果顯示，部分定植的細(xì)胞可表達(dá)MMP-9和-13，但大部分MMP-9和-13的合成來源于內(nèi)源性肝組織細(xì)胞。
　　【結(jié)論】
　　本研究證實(shí)了PBSCs中CD14+單核細(xì)胞具有干細(xì)胞潛能，該亞群細(xì)胞的移植較CD1