Golgi體在外周血單核細胞TLR4超敏中的作用及NPY抑制效應.pdf

1、目的：
　　 臨床觀察發(fā)現，嚴重創(chuàng)傷病人膿毒血癥發(fā)生率明顯增加。一些研究認為，創(chuàng)傷后組織、細胞破碎產物能夠初步激活免疫系統(tǒng)，如果此時再發(fā)生病原微生物入侵，其結果是炎癥因子過度釋放，并提出TLR4超敏的概念。已有研究發(fā)現，炎癥細胞Golgi體內存在大量TLR4，但其在膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中有何作用，是否參與了創(chuàng)傷后膿毒癥過程中TLR4超敏反應，目前尚不清楚；既往已有資料證實神經肽Y可抑制炎癥反應，它能否抑制致敏細胞過度釋放炎癥因子

2、，尚待證實。為此，本課題擬以健康正常人免疫細胞PBMC為對象，通過建立PBMC TLR4的致敏細胞模型，旨在探索Golgi體在TLR4超敏中的作用及神經肽Y對超敏細胞釋放炎癥因子的影響，以期深入了解TLR4致敏的機制，同時為治療創(chuàng)傷后過度炎癥反應提供新的途徑。
　　 方法：
　　 1.梯度離心法從濃縮人外周血白細胞中分離出PBMC，以1×106/ml接種于24孔細胞培養(yǎng)板，實驗設立空白對照組、Fn組、LPS組、Fn+LP

3、S復合組，以5ug/ml Fn或(和)1ug/mlLPS刺激PBMC0.5、2、4、8、12h后收集細胞培養(yǎng)上清，酶聯免疫法(ELISA)檢測其炎癥因子IL-6、TNF-α和IL-10水平；Western blot法檢測各處理組TLR4的表達量。
　　 2.PBMC分離培養(yǎng)同前，設立空白對照組、Fn組、NPY+Fn組、LPS組、NPY+LPS組、Fn+LPS組和NPY+Fn+LPS組，先以NPY5ug/ml預處理PBMC2h，再

4、加入5ug/ml Fn或(和)1ug/ml LPS繼續(xù)刺激細胞0.5、2、4、8、12h，檢測各組細胞培養(yǎng)上清IL-6、TNF-α和IL-10水平和細胞TLR4的表達量。
　　 3.設立Fn組、BFA+Fn組、Fn+LPS組和BFA+Fn+LPS組，用布雷菲德菌素A(brefeldinA，BFA)5ug/ml預處理PBMC3h，去除含BFA的培養(yǎng)基并洗滌細胞3次，再以5ug/ml Fn或(和)1ug/ml LPS處理PBMC0.

5、5、2、4、8、12h，檢測各組細胞培養(yǎng)上清IL-6、TNF-α和IL-10水平和細胞TLR4的表達量。
　　 結果：
　　 1.Fn對LPS刺激PBMC合成和釋放炎癥因子的影響
　　 (1)IL-6：空白對照組各時相點IL-6均處于低水平表達，不同時相點比較無統(tǒng)計學差異(p>0.05)；處理0.5h后，Fn組、LPS組和Fn+LPS組IL-6釋放量未見明顯增加(p>0.05)；處理2h后，Fn+LPS組較之Fn

6、組和LPS組，IL-6釋放水平增加明顯(p<0.05)；處理8h后，Fn+LPS組IL-6達釋放峰值，與空白對照組、Fn組及LPS組比較，差異非常顯著(p<0.05)：
　　 (2)TNF-α：處理0.5h后，各組之間TNF-α產生水平未見顯著差異(p>0.05)；與空白對照組、Fn組及LPS組比較，Fn+LPS組在處理2h、4h、8h、12h后，TNF-α均有所增加(p<0.05)。
　　 (3)IL-10：與空白對照

7、組、Fn組及LPS組比較，Fn+LPS組在處理0.5h、2h后，IL-10釋放量均無明顯增加(p>0.05)；處理4h后，Fn+LPS組較之Fn組和LPS組，IL-10釋放水平增加明顯(p<0.05)，其增加趨勢也出現在8h和12h。
　　 (4)TLR4：與LPS組比較，Fn+LPS組在處理0.5h后，TLR4表達量無明顯增加(p>0.05)；處理2h、4h后，Fn+LPS組TLR4表達量明顯增加，與同時相點其它3組比較差異顯

8、著(p<0.05)。
　　 2.NPY對Fn增敏LPS刺激PBMC釋放炎癥因子作用的影響
　　 (1)IL-6：處理0.5h后，NPY+Fn組較之Fn組IL-6釋放量無明顯減少(p>0.05)；與LPS組比較，各時相點NPY+LPS組IL-6釋放量無明顯減少(p>0.05)；處理2h后，NPY+Fn組和NPY+Fn+LPS組IL-6釋放量分別低于Fn組和Fn+LPS組(p<0.05)，這種抑制作用也出現在4h和8h。

9、r>　　 (2)TNF-α：處理PBMC2h、4h后，NPY+Fn組較之Fn組，NPY+Fn+LPS組較之Fn+LPS組，TNF-α的釋放量明顯減少(p<0.05)，但高于同時間空白對照組和Fn組；處理8h、12h后，NPY+Fn組較之Fn組，TNF-α釋放量未見顯著減少(p>0.05)。
　　 (3)IL-10：與Fn組比較，NPY+Fn組在處理0.5h、2h后，IL-10釋放量無顯著減少(p>0.05)；處理4h、8h后，

10、NPY+Fn組較之Fn組，NPY+Fn+LPS組較之Fn+LPS組，IL-10釋放量顯著減少(p<0.05)。
　　 (4)TLR4：與Fn組比較，NPY+Fn組在處理0.5h后，TLR4表達量未見明顯減少(p>0.05)；處理2h和4h后，NPY+Fn組較之Fn組，NPY+Fn+LPS組較之Fn+LPS組，TLR4表達量顯著降低(p<0.05)。
　　 3.BFA干擾Golgi體蛋白轉運后對炎癥因子合成和釋放的影響

11、r>　　 (1)處理PBMC0.5h、2h、4h后，BFA+Fn組較之Fn組，BFA+Fn+LPS組較之Fn+LPS組，IL-6、TNF-α、IL-10釋放量均明顯減少(p<0.05)。
　　 (2)TLR4：與Fn組比較，BFA+Fn組在處理0.5h、2h、4h后，TLR4表達量顯著降低(p<0.05)；與Fn+LPS組比較，BFA+Fn+LPS組在處理0.5h、2h后，TRLA表達量顯著降低(p<0.05)。
　　

12、 結論：
　　 1.Fn單獨處理PBMC可以導致炎癥因子釋放增加，Fn復合LPS刺激，炎癥因子進一步釋放，且TLR4也呈現相應的表達趨勢，提示Fn能夠增加PBMC TLR4對LPS的敏感性。
　　 2.NPY能夠抑制Fn對PBMC的致敏作用，從而減少炎癥因子的釋放，可能的抑制機制是通過減少TLR4的表達實現。
　　 3.BFA抑制PBMC Golgi體蛋白轉運作用，使Fn處理后TLR4表達和炎癥因子釋放均減少，G