急性冠脈綜合征患者外周血單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)及阿托伐他汀和中藥厚樸酚對(duì)其的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、背景與目的：業(yè)已證明動(dòng)脈粥樣硬化是一種慢性炎癥性疾病，伴有免疫反應(yīng)的炎癥過(guò)程貫穿于動(dòng)脈粥樣硬化的始終。一般說(shuō)來(lái)，免疫系統(tǒng)通過(guò)兩種互相關(guān)聯(lián)的方式對(duì)有害成分進(jìn)行有效的防御：即先天性和獲得性免疫反應(yīng)。先天性免疫系統(tǒng)介導(dǎo)的免疫反應(yīng)是第一道防線，主要識(shí)別高度保守的病原序列，即病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecularpatterns，PAMPs)，在第一道防御反應(yīng)中能識(shí)別這些PAMPs的受體有TOLL，樣受體(t

2、oll-like receptors，TLRs)和清道夫受體。除了他們?cè)谙忍煨悦庖咧衅痍P(guān)鍵性作用外，近來(lái)還發(fā)現(xiàn)TLRs尤其是TOLL樣受體4(TLR4)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)脈粥樣斑塊中的內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、血管外膜成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等的TLR4表達(dá)是上調(diào)的。斑塊中TLR4的表達(dá)使人們推測(cè)TLR4與動(dòng)脈硬化性疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。 冠狀動(dòng)脈粥樣斑塊的不穩(wěn)定是導(dǎo)致臨床綜合征包括不穩(wěn)定心絞痛和心肌梗死的

3、病理基礎(chǔ)。血管壁的炎癥反應(yīng)是引起斑塊不穩(wěn)定的主要原因。與慢性穩(wěn)定性心絞痛患者相比，急性冠脈綜合征(acute coronarysyndrome,ACS)患者冠狀動(dòng)脈斑塊內(nèi)含有更多的單核巨噬細(xì)胞，這些細(xì)胞處于激活狀態(tài)，通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子如腫瘤壞死因子(TNF)-α,白介素(IL)-6等，血管壁的炎癥反應(yīng)加劇，斑塊的破裂，進(jìn)一步引起臨床并發(fā)癥的發(fā)生。有證據(jù)顯示TLR4與粥樣斑塊的不穩(wěn)定密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)apoE缺乏的小鼠敲除TLR4基因后

4、主動(dòng)脈粥樣斑塊縮小，同時(shí)發(fā)現(xiàn)TLR4缺乏與斑塊的組成改變有關(guān)，即斑塊內(nèi)脂質(zhì)和單核巨噬細(xì)胞減少，炎癥因子的表達(dá)明顯降低，這些變化均是斑塊結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的指標(biāo)，由此推斷TLR4炎癥信號(hào)途徑參與了斑塊不穩(wěn)定的過(guò)程。目前對(duì)于循環(huán)中單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)與冠狀動(dòng)脈粥樣硬化臨床表現(xiàn)的關(guān)系研究較少。本實(shí)驗(yàn)的目的之一是通過(guò)對(duì)比冠狀動(dòng)脈硬化性心臟病(冠心病)的不同臨床類型患者外周血單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)，研究TLR4與粥樣斑塊進(jìn)展和破裂之間的關(guān)系，為臨床防治急

5、性冠脈事件的發(fā)生提供治療途徑。 他汀類藥物即(3-羥基3甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑)是目前臨床應(yīng)用最廣泛的調(diào)脂藥物，它通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽固醇合成的限速酶而降低血中膽固醇濃度。此外它能降低動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的發(fā)病率和死亡率。但是他汀類藥物所帶來(lái)的臨床益處遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其降脂作用。他汀類藥物抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用與其的抗炎作用有關(guān)。他汀類藥物能抑制核因子(NF)-kB的活性，從而導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子如TNF-α，IL-6等水平的下降。另外他汀類

6、藥物能抑制脂多糖(LPS)刺激的內(nèi)皮細(xì)胞及外周血單核細(xì)胞的激活。本實(shí)驗(yàn)的目的之一是研究他汀類藥物對(duì)ACS患者外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)及下游炎癥因子水平的影響，探討他汀類藥物抗炎穩(wěn)定斑塊的機(jī)制。 厚樸酚(Mag)是從傳統(tǒng)的中草藥厚樸中提取的物質(zhì)。近來(lái)發(fā)現(xiàn)它具有抗血小板聚集，血管擴(kuò)張，抗腫瘤及抗炎作用。厚樸酚對(duì)慢性炎癥性疾病如動(dòng)脈粥樣硬化，哮喘，腫瘤等具有治療價(jià)值。厚樸酚的抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用可能與其抗炎作用有關(guān)。但對(duì)其抗炎的確切

7、機(jī)制還不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究厚樸酚對(duì)ACS患者外周血單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)和炎癥因子水平的影響，來(lái)探討它在動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的防治方面的機(jī)制，為中藥治療動(dòng)脈粥樣硬化性疾病提供理論依據(jù)。 方法：(1)將121例參加實(shí)驗(yàn)者分為三組：對(duì)照組(22例)，穩(wěn)定性心絞痛(SA)組17例，急性冠脈綜合征組(82例)。測(cè)定外周血CD14+單核細(xì)胞TLR4的表達(dá)，血超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP)的濃度，IL-12和TNF-α的水平。采用流式細(xì)胞儀方

8、法測(cè)定單核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)，ELISA法測(cè)定IL-12和TNF-α的含量。 (2)將41例ACS患者在常規(guī)抗缺血治療的基礎(chǔ)上隨機(jī)分為兩組：阿托伐他汀標(biāo)準(zhǔn)治療組(10mg/d)及強(qiáng)化治療組(40mg/d)，觀察治療前和治療一月后血脂、單核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)，血hsCRP，IL-12和TNF-α水平的變化。分離并培養(yǎng)ACS患者外周血單核細(xì)胞，并分以下5組進(jìn)行體外干預(yù)24小時(shí)：A：對(duì)照組(1640培養(yǎng)基)；B：LPS組(LP

9、S 1mg/L)；C：他汀(Statin)組(阿托伐他汀10μmol/L)；D：LPS+Statin組；E：LPS+Statin+甲羥戊酸組(50010μmol/L)。采用RT-PCR法測(cè)定培養(yǎng)單核細(xì)胞TLR4mRNA的表達(dá)，ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中IL-12和TNF-α水平。 (3)分離并培養(yǎng)ACS患者外周血單核細(xì)胞，并分以下4組進(jìn)行體外干預(yù)24小時(shí)：A：對(duì)照組(1640培養(yǎng)基)；B:LPS組(LPS1mg/L)；

10、 C：厚樸酚組(20 μM)；D：LPS+厚樸酚組。采用RT-PCR法測(cè)定培養(yǎng)單核細(xì)胞TLR4mRNA的表達(dá)，ELISA法測(cè)定細(xì)胞上清液中IL-12和TNF-α水平。 結(jié)果： (1)ACS患者外周血CD14+單核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)明顯高于SA患者(p<0.05)及對(duì)照組(p<0.05)，ACS患者血hsCRP、血清IL-12、TNF-α的濃度均明顯高于SA患者及對(duì)照組(p<0.05)；hsCRP與TLR4的相關(guān)性分析

11、結(jié)果是兩者明顯正相關(guān)(r=0.261，p=0.002)。 (2)ACS患者經(jīng)阿托伐他汀治療一月后外周血CD14+單核細(xì)胞表面TLR4的表達(dá)明顯下調(diào)(p<0.05)，同時(shí)血hsCRP、血清IL-12、TNF-α的濃度也明顯下降(p<0.05)，阿托伐他汀強(qiáng)化治療組的作用強(qiáng)于標(biāo)準(zhǔn)治療組(p<0.05)。離體培養(yǎng)，甲羥戊酸可逆轉(zhuǎn)阿托伐他汀對(duì)ACS患者外周血單核細(xì)胞TLR4mRNA表達(dá)的下調(diào)(p<0.05)，同時(shí)也阻斷其對(duì)TLR4下游炎

12、癥因子IL-12和TNF-α水平的下調(diào)作用(p<0.05)。 (3)厚樸酚能下調(diào)分離培養(yǎng)的.ACS患者外周血單核細(xì)胞TLR4mRNA的表達(dá)(p<0.05)，同時(shí)能明顯降低其下游炎癥因子IL-12和TNF-α水平(p<0.05)。 結(jié)論： (1)急性冠脈綜合征的發(fā)生與循環(huán)中單核細(xì)胞TLR4表達(dá)的上調(diào)和血炎癥因子水平明顯升高有關(guān)。 (2)他汀類藥物抗炎穩(wěn)定斑塊的作用可能與其抑制TLR4炎癥通路有關(guān)，且通過(guò)甲羥