下調(diào)TLR4預(yù)防再狹窄的作用及其與吡格列酮抑制效應(yīng)的比較.pdf

1、目的：
　　近些年來，經(jīng)皮穿刺腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)（percutaneous transluminal coronary angioplasty,PTCA）和經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)（percutaneous coronary intervention,PCI）已逐漸成為冠心病及急性冠脈綜合征血運(yùn)重建的重要治療手段。然而，術(shù)后再狹窄（restenosis，RS）卻制約著這項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展。盡管藥物洗脫支架的問世在一定程度上降低了再狹窄的

2、發(fā)生率，但是越來越多的研究發(fā)現(xiàn)藥物洗脫支架也并非十全十美，仍面臨如遠(yuǎn)期炎癥狀態(tài)、支架內(nèi)血栓形成以及RS等等問題?；诖?，我們擬探究是否存在更好的再狹窄預(yù)防手段，以期與現(xiàn)有的保護(hù)措施結(jié)合起來，進(jìn)一步降低這種并發(fā)癥的發(fā)生率。
　　Toll樣受體4（toll like receptor4，TLR4）是哺乳動(dòng)物TLR家族里第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的膜受體，其活化后可以激活核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB），繼而誘發(fā)一系列的局

3、部炎癥反應(yīng)，最終表現(xiàn)為損傷部位內(nèi)膜增生，因此推測其在血管損傷后再狹窄過程中可能發(fā)揮重要作用。但是抑制TLR4表達(dá)后是否會減少再狹窄的發(fā)生尚不明確。
　　本研究通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)TLR4基因，以病毒顆粒包裝將質(zhì)粒載入動(dòng)物RS模型以及被脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激增殖下的人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞（Human aortic vascular smooth musclecells,HaVSMC）中，測定TL

4、R4相關(guān)的炎癥、增殖分子，觀察下調(diào)TLR4對內(nèi)膜新生的抑制程度，以及離體水平細(xì)胞增殖、遷移能力產(chǎn)生的影響，探討抑制TLR4基因表達(dá)在預(yù)防RS中的作用機(jī)制。此外，我們比較了RNA干擾與不同濃度吡格列酮對細(xì)胞增殖遷移能力的抑制效力。
　　方法：
　　1.在體實(shí)驗(yàn)：根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期工作基礎(chǔ)，建立兔頸總動(dòng)脈球囊損傷后再狹窄模型：選取健康新西蘭大白兔50只，隨機(jī)分成五組，即正常組(normal control,NC)，假手術(shù)組(sha

5、me,S)，模型組(model,M)，陰性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(negative,N)，以及陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組(positive,P)，每組10只。NC組不予任何干預(yù)；S組行頸總動(dòng)脈分離后動(dòng)脈夾夾閉右側(cè)頸總動(dòng)脈30分鐘；M組行右頸總動(dòng)脈球囊拉傷術(shù)；N組在進(jìn)行右側(cè)頸動(dòng)脈球囊拉傷后隨即封閉拉傷段血管，排空積血，管腔內(nèi)注射空載的腺病毒顆粒（滴度1*109plaque forming unit,pfu）30ul，溫暖潮濕環(huán)境孵育30min；P組在進(jìn)行右側(cè)頸動(dòng)

6、脈球囊拉傷后管腔內(nèi)注射載有shRNA-TLR4質(zhì)粒的腺病毒顆粒（滴度1*109 pfu）30ul，余操作同N組。術(shù)后正常兔料喂養(yǎng)14天后處死，進(jìn)行以下步驟：
　　（1）處死前取血，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測血漿中TNF-α、IL-6水平；
　　（2）留取右頸動(dòng)脈標(biāo)本，進(jìn)行HE染色，測量內(nèi)膜和中膜厚度并計(jì)算內(nèi)膜和中膜面積；應(yīng)用免疫組化法觀察組織TLR4表達(dá)。
　?。?）留取右頸動(dòng)脈標(biāo)本，采用Real-Time

7、PCR測定TLR4、TNF-α、IL-6和VCAM-1 mRNA表達(dá)；
　?。?）Western blotting檢測TLR4，炎癥因子NF-κB、VCAM-1、MCP-1以及增殖因子t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR蛋白的表達(dá)。
　　2.離體實(shí)驗(yàn)：選取HaVSMC細(xì)胞系，分別予1μg/ml LPS刺激0h、6h、12h、24h以及48h，確定TLR4表達(dá)的峰值時(shí)間點(diǎn)。設(shè)計(jì)、構(gòu)建2對針對TLR4特異性的shR

8、NA表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行慢病毒包裝，使用帶有綠色熒光蛋白的慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA-TLR4-1，shRNA-TLR4-2和陰性對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人血管平滑肌細(xì)胞系，在熒光倒置顯微鏡下檢測以確認(rèn)轉(zhuǎn)染效果，并選擇TLR4抑制效率更高的一組作為shRNA陽性轉(zhuǎn)染組（positive,P），另外保留陰性轉(zhuǎn)染組（negtive,N），不加LPS刺激組（NL）以及單加LPS刺激組（L），再設(shè)三組分別給予10μmol/L（Pio10），50μmol/L（Pi

9、o50），以及100μmol/L（Pio100）吡格列酮進(jìn)行預(yù)處理，除NL外各組分別予1μg/ml LPS刺激使TLR4表達(dá)達(dá)到峰值，收細(xì)胞，RT-PCR測定TLR4 mRNA表達(dá)；Western blotting檢測TLR4、NF-κB、VCAM-1、MCP-1，再測接受LPS刺激1h后上述各組t-AKT、p-AKT的蛋白表達(dá)；MTT比色法分別測定細(xì)胞增殖生長狀況；劃痕實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞24h及48h劃痕修復(fù)率；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布情

10、況。
　　結(jié)果：
　　1.在體部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　?。?）有創(chuàng)操作成功且存活占83.3％（40/48）；
　?。?）ELISA結(jié)果顯示：與NC組相比，S、M、N和P組血漿IL-6、TNF-α表達(dá)水平顯著升高（p<0.05）；與M及N組比較，P組血漿IL-6、TNF-α表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.05）；
　?。?）HE染色結(jié)果顯示，與NC組和S組相比，M、N和P組內(nèi)膜和中膜均增厚，內(nèi)中膜厚度比及內(nèi)中膜面積比均明

11、顯增大（p<0.05）；與M和N組相比，P組內(nèi)中膜厚度、內(nèi)中膜厚度比及內(nèi)中膜面積比均明顯減少（p<0.05）。免疫組化結(jié)果表明：NC組及S組血管三層結(jié)構(gòu)中均未見到TLR4陽性表達(dá)細(xì)胞；M、N及P組均有TLR4陽性表達(dá)細(xì)胞，主要分布在新生內(nèi)膜層；
　?。?）qRTPCR結(jié)果顯示：與NC組和S組相比，M、N和P組TLR4、IL-6、TNF-α和VCAM-1 mRNA表達(dá)量升高（P＜0.05），與M組及N組相比，P組上述因子表達(dá)量降低（

12、P＜0.05）；
　　(5)Western-blot結(jié)果顯示：與NC組和S組相比，M、N和P組TLR4、NF-κB、MCP-1、VCAM-1、p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)量升高（P＜0.05）；與M和N組相比，P組TLR4、NF-κB、MCP-1和VCAM-1蛋白表達(dá)量下降（P＜0.05），p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)量無明顯變化（p>0.05）。
　　2.離體部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
　　（1）1μg/mL LPS刺激

13、HaVSMC可激活TLR4，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，24h達(dá)到其表達(dá)峰值；
　?。?）兩條shRNA-TLR4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞對TLR4抑制效率可達(dá)61%及55%；
　　（3）qRT-PCR示P組及吡格列酮預(yù)處理各組均可下調(diào)TLR4 mRNA表達(dá)量；
　?。?）WB示各組TLR4、NF-κB、MCP-1及VCAM-1表達(dá)及關(guān)系與qRT-PCR結(jié)果類似，LPS刺激后1h即可上調(diào)p-AKT表達(dá)量，而shRNA-TLR4質(zhì)粒及吡格

14、列酮均可明顯抑制其表達(dá)；
　?。?）LPS可以提高細(xì)胞增殖能力，shRNA-TLR4質(zhì)粒及吡格列酮能夠抑制增殖；
　?。?）流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，LPS可以提高細(xì)胞在G2及S期的分布，shRNA-TLR4質(zhì)粒及吡格列酮可減弱此效應(yīng)；
　?。?）LPS促進(jìn)細(xì)胞遷移，shRNA-TLR4質(zhì)粒及吡格列酮可抑制遷移；
　　（8）以上吡格列酮對于細(xì)胞增殖、遷移能力的抑制以及對細(xì)胞周期分布的影響呈濃度依賴性，對上述各炎癥因子表

15、達(dá)的下調(diào)作用也存在濃度依賴性。
　?。?）shRNA-TLR4穩(wěn)轉(zhuǎn)HaVSMC細(xì)胞系對細(xì)胞增殖及遷移能力的抑制程度介于50μM-100μM吡格列酮之間。
　　結(jié)論：
　　下調(diào)TLR4可以抑制家兔頸動(dòng)脈球囊損傷后再狹窄的發(fā)生，可能與其抑制局部組織TLR4及其介導(dǎo)的NF-κB、TNF-α、IL-6、MCP-1、VCAM-1等炎癥因子的表達(dá)有關(guān)。下調(diào)TLR4可以抑制由LPS激活的HaVSMC增殖遷移，其作用類同于50μM-1