牛外周血中單核細胞和巨噬細胞及其TLRs家族基因的相關(guān)研究.pdf

1、單核細胞和巨噬細胞在抵抗和防御病原體感染中發(fā)揮了重要作用，尤其是在細胞內(nèi)的病原體防御中發(fā)揮了巨大作用。根據(jù)組織內(nèi)環(huán)境以及它們自身所處的不同分化階段，它們都表現(xiàn)出不同的形態(tài)、機能和代謝作用。這些細胞可以通過細胞表面表達的TLR來識別和結(jié)合PAMP引發(fā)信號傳導通路從而激發(fā)宿主的防御系統(tǒng)。至今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了TLR1-TLR10的部分基因序列，然而對牛外周血單核細胞及其巨噬細胞中Toll樣受體的表達形式還不清除。因此本試驗采取單核細胞以及由來

2、巨噬細胞進行研究，主要研究牛外周血中此類細胞Toll樣受體的表達形式，及其在LPS刺激條件下細胞因子的表達，從而得知該細胞在宿主免疫中發(fā)揮的重要作用。 試驗一：牛外周血單核細胞和巨噬細胞分離培養(yǎng)和純化方法 本試驗采用流式細胞分離儀和磁性細胞分離儀分離和鑒定了外周血中單核細胞及其由來的巨噬細胞，通過使用Repcell細胞培養(yǎng)板培養(yǎng)巨噬細胞，改進了TaflonBag培養(yǎng)巨噬細胞的方法，且單核細胞和巨噬細胞的分離百分率分別為9

3、7.9％和73.9％。從而簡化的了試驗步驟，為以后的試驗奠定了堅實的基礎(chǔ)。 試驗二：牛外周血單核細胞和巨噬細胞Toll樣受體mRNA水平的表達形式 通過RT-PCR和NIH光密度成像系統(tǒng)分析得到單核細胞和巨噬細胞TLRsmRNA的表達形式，并測得在LPS刺激時，TLRs家族中不同TLR對LPS的反應(yīng)能力。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞在LPS刺激24h后，IL-6和TNF-αmRNA的表達量顯著升高(P<0.05)，表達量分別為2.

4、02±0.48和1.66±0.39。與此同時IL-8 mRNA的表達量相對提高，即2.14±0.52。TLR1、TLR3、TLR5、TLR8和TLR10的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物顯著下降(P<0.05)，然而TLR2、TLR4、TLR6和TLR7則保持穩(wěn)定。另外單核細胞的Toll樣受體1-10以及細胞因子的表達量在LPS刺激前后保持穩(wěn)定，其中TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和TLR10的表達量高于1.0，IL-8和IL-6的表

5、達量大于TNF-α，它們在LPS刺激后的表達量分別為1.384±0.41、1.474±0.17和1.214±0.51，與單核細胞相似的是TLR9不管是在正常培養(yǎng)條件下還是LPS刺激條件下都沒有表達。試驗結(jié)果表明，巨噬細胞在受到病原刺激后通過提高IL-6和TNF-α mRNA的表達量從而提高了天然免疫的作用。該研究為探討巨噬細胞在天然免疫中的作用奠定了基礎(chǔ)。 第三章：牛外周血單核細胞和巨噬細胞中Toll樣受體蛋白質(zhì)水平的表達形式

6、 本試驗通過使用熒光免疫染色、流式細胞分離儀和共聚焦電鏡，分析得知TLR2和TLR4在單核細胞和巨噬細胞表面的分布形式以及蛋白水平的表達量，并研究了在LPS刺激條件下，TLR2和TLR4的變化情況。試驗結(jié)果表明，單核細胞和巨噬細胞在受到LPS刺激24h后，TLR2和TLR4蛋白水平表達量相對提高，分別為34.1％、47.1％和22.4％、10.1％，TLR2和TLR4蛋白水平的表達量與mRNA水平的表達形式一致，從而充分證實了TL