小鼠B7-DC基因沉默對樹突狀細胞誘導的抗乙肝病毒免疫的研究.pdf

1、乙型肝炎病毒是一種非細胞裂解性病毒,它是引起急、慢性肝炎的主要病原。研究發(fā)現(xiàn),在慢性乙肝患者體內(nèi)的CD8+ T細胞的增殖和效應能力很弱,提示了增強病毒特異性T細胞的反應能力可能是控制慢性乙肝病毒持續(xù)感染的一條途徑。目前,樹突狀細胞疫苗被公認為是抗腫瘤和抗慢性病毒感染的有效方法之一。
　　因此,基于樹突狀細胞的治療性疫苗對于乙肝的免疫治療是可行的。許多研究表明,B7家族提供的共刺激信號對促進和抑制T細胞活化具有至關重要的作用。B7-

2、DC是B7家族的第五個成員,被認為是PD-1的第二個配體,可以負向調(diào)節(jié)T細胞的活化。B7-DC選擇性表達于樹突狀細胞上,因此,如果阻斷樹突狀細胞與T細胞B7-DC/PD-1間的相互作用,有可能使樹突狀細胞誘導更強的T細胞反應。RNA干擾是一種新穎的基因調(diào)節(jié)機制,是通過雙鏈RNA介導的轉(zhuǎn)錄后基因沉默技術,它是目前封閉基因表達行之有效的方法之一。
　　本研究中,我們從小鼠骨髓來源的未成熟樹突狀細胞中提取總RNA,經(jīng)RT-PCR擴增B7

3、-DC胞外段,并將其克隆至原核表達載體pET32a（+）中,構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET32a（+）-B7-DCECD。重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定及序列測定后,轉(zhuǎn)化E.coliBL21,經(jīng)IPTG誘導表達目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot進行檢測。
　　實驗結(jié)果表明,成功獲得全長為582 bp的小鼠B7-DC胞外段基因,經(jīng)測序證實其序列正確。SDS-PAGE和Western blot分析證實重組質(zhì)?？杀磉_出Mr約為41

4、000的B7-DC胞外段蛋白。同時我們對攜帶有針對目標基因的shRNA在抑制樹突狀細胞上B7-DC基因的表達水平,以及基因修飾的樹突狀細胞的功能方面作了初步的研究。成功構(gòu)建兩個siRNA真核表達載體并在體外轉(zhuǎn)染樹突狀細胞,檢測結(jié)果表明兩個siRNA真核表達載體均可抑制樹突狀細胞上B7-DC基因的表達,重組干擾質(zhì)粒shRNA1-B7-DC和shRNA2-B7-DC抑制B7-DC基因的效率分別為61.4％、45.9%?；旌狭馨图毎磻蠦7

5、-DC基因沉默的樹突狀細胞可顯著刺激同種異體T淋巴細胞增殖。將基因修飾的樹突狀細胞免疫HBV轉(zhuǎn)基因小鼠,檢測結(jié)果表明在效:靶比為50:1時,經(jīng)shRNA1-B7-DC轉(zhuǎn)染后致敏的DCs細胞免疫組小鼠脾細胞CTL殺傷活性顯著高于空載體pAS轉(zhuǎn)染組和非轉(zhuǎn)染組,提示樹突狀細胞中B7-DC基因沉默后誘導更強的CTL殺傷活性。此外,我們檢測了免疫小鼠血清中乙肝表面抗原的水平和血清中HBV DNA的濃度。
　　結(jié)果顯示,乙肝病毒特異性表位肽脈