負載HBeAg的樹突狀細胞功能及抗乙肝病毒作用的研究.pdf

1、目的： ①通過檢測外周血來源的樹突狀細胞(DC)功能，比較免疫耐受期患者和低或非復制期患者的DC功能是否存在差異，以探討乙型肝炎病毒(HBV)感染者乙肝e抗原(HBeAg)血清轉(zhuǎn)換與DC功能的關(guān)系； ②研究體外負載HBeAg能否促進DC成熟，增強DC功能；③觀察DC經(jīng)HBeAg刺激，體外誘導特異性T淋巴細胞后，對HepG2.2.15細胞中HBV mRNA表達及蛋白合成的影響。 方法： 1、收集免疫耐受期患

2、者11例、低或非復制期患者13例，另外選擇10例各型肝炎病原學標志檢測均為陰性的健康體檢者為正常對照組，分離外周血單個核細胞(PBMC)，體外添加thGM-CSF、rhIL-4誘導培養(yǎng)DC，分為兩組，分別加或不加HBeAg體外刺激，然后用thTNF-α促成熟，光鏡觀察細胞形態(tài)，流式細胞儀檢測DC表面分子CD80、CD86和HLA-DR的表達量，CCK-8法檢測DC在同種異體混合淋巴細胞反應(MLR)中刺激T淋巴細胞增殖的能力，酶聯(lián)免疫吸

3、附試驗(ELISA)檢測IL-12的分泌量。 2、自正常人PBMC中誘導培養(yǎng)DC，經(jīng)不同濃度的HBeAg負載后與自身T淋巴細胞共同培養(yǎng)，誘導產(chǎn)生HBeAg特異性T細胞，同時設(shè)與無HBeAg刺激的DC共同培養(yǎng)的T細胞、單純T細胞為對照組，作用于HepG2.2.15細胞系，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測HepG2.2.15細胞內(nèi)乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝核心抗原(HBcAg)的mRNA水平，ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清

4、中HBsAg和HBeAg水平。 結(jié)果： 1、體外用含rhGM-CSF和thIL-4的RPMI-1640完全培養(yǎng)液誘導人的PBMC，可見貼壁細胞逐漸懸浮，并呈細胞積聚現(xiàn)象，形態(tài)不規(guī)則呈樹突樣突起；收集第9天的懸浮細胞，細胞計數(shù)板計數(shù)達2.0×106/10ml外周血，經(jīng)掃描電鏡觀察可見細胞表面有大量的皺褶及細而長的刺狀突起，流式檢測DC純度達80％以上，且高表達CD86、CD80、HLA-DR，具有典型的DC特異性標志。

5、 2、對11例免疫耐受期患者、13例低或非復制期患者和10例正常人外周血來源DC的成熟度和功能檢測發(fā)現(xiàn)：①免疫耐受期患者DC表面CD80、CD86、HLA-DR的表達量顯著低于低或非復制期患者和正常人(P<0.05)，但低或非復制期患者和正常人組的DC表面的3個分子表達量無明顯差異(P>0.05)；②當DC/T比值為1：5、1：10時，免疫耐受期患者DC刺激淋巴細胞增殖的能力顯著低于低或非復制期患者和正常人(P<0.05)，而低或非

6、復制期患者和正常人組無明顯差異(P>0.05)；③ELISA檢測MLR中DC分泌IL-12 p70的水平，發(fā)現(xiàn)免疫耐受期患者IL-12p70的含量明顯低于低或非復制期患者和正常人(P<0.05)，而低或非復制期患者與正常組無明顯差異(P>0.05)。 3、將培養(yǎng)至第6天的DC經(jīng)HBeAg刺激24小時后檢測發(fā)現(xiàn)：①光鏡觀察HBeAg刺激組和對照組的DC形態(tài)和細胞數(shù)量無明顯差異(P>0.05)；②流式細胞儀分析顯示，HBeAg刺激組

7、的DC表面分子表達率在免疫耐受期患者組、低或非復制期患者組與正常人組均較對照組升高(P<0.05)，CD86和HLA-DR的表達率在免疫耐受期、低或非復制期以及正常人3組間無顯著性差異(P>0.05)，而免疫耐受期患者的CD80表達率低于其他兩組(P<0.05)；③MLR實驗顯示，HBeAg刺激組的DC刺激同種異體T淋巴細胞增殖的能力較對照組增強(P<0.05)，在DC：T比例為1：5、1：10、1：20時，免疫耐受期、低或非復制期以及

8、正常人3組間的刺激指數(shù)無顯著性差異(P>0.05)；④ELISA檢測HBeAg刺激組和對照組IL-12p70的水平，發(fā)現(xiàn)HBeAg刺激組DC分泌IL-12p70的水平在免疫耐受期患者組、低或非復制期患者組與正常人組均較對照組明顯升高(P<0.05)，3組間細胞因子水平無顯著性差異(P>0.05)。 4、經(jīng)HBeAg刺激激活的T細胞可以有效的抑制HBsAg、HBcAg mRNA的表達，以及HBsAg、HBeAg的合成(P<0.05

9、)，且隨著HBeAg刺激濃度的升高，上述指標的表達量逐漸降低。 結(jié)論： 1、利用GM-CSF和IL-4可以從人外周血中擴增出大量DC，為后續(xù)研究做準備。 2、免疫耐受期患者的DC的成熟和功能存在障礙，低或非復制期患者DC功能明顯強于前者，DC功能的狀態(tài)可能是發(fā)生血清轉(zhuǎn)換的重要原因。 3、HBeAg體外負載可以提高DC功能，可能對增強免疫耐受期患者的HBeAg特異性免疫應答有重要作用。 4、HBeA