Stnfrl基因修飾的未成熟DC對(duì)異基因骨髓移植小鼠CVHD和GVL的影響.pdf

1、目的:以含有人可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅰ(sTNFRⅠ)的慢病毒表達(dá)載體感染未成熟樹突狀細(xì)胞(imDC),對(duì)其進(jìn)行鑒定并檢測(cè)sTNFRⅠ蛋白的表達(dá)以及刺激淋巴細(xì)胞增殖能力,并通過淋巴瘤細(xì)胞白血病小鼠模型,觀察其對(duì)異基因骨髓移植中移植物抗宿主病(GVHD)和移植物抗白血病效應(yīng)(GVL)的調(diào)控作用。
　　 方法:
　　 1、中量提取重組質(zhì)粒sTNFRⅠ,載體質(zhì)粒pXZ9,包裝質(zhì)粒ANRF及包膜質(zhì)粒pVSVG,采用陽離子脂質(zhì)體法

2、共轉(zhuǎn)染293 FT細(xì)胞,在轉(zhuǎn)染后48、72、96 h收集上清,獲得攜帶sTNFRⅠ基因的重組慢病毒及含空載體pXZ9的慢病毒。取BALB/c小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞以1640完全培養(yǎng)基(GM-CSF20 ng/mL;IL-410ng/mL)培養(yǎng)樹突狀細(xì)胞(DC),并以細(xì)菌脂多糖(LPS)刺激使其成熟,光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型。以收獲的兩種慢病毒感染樹突狀細(xì)胞,通過EGFP報(bào)告基因的表達(dá)檢測(cè)感染率,以Western blot檢

3、測(cè)細(xì)胞中sTNFRⅠ蛋白的表達(dá),通過CCK-8法進(jìn)行淋巴細(xì)胞增殖能力的檢測(cè)。
　　 2、復(fù)制C57BL/6小鼠淋巴瘤細(xì)胞白血病模型,將sTNFRⅠ基因修飾的DC輸入異基因骨髓移植小鼠體內(nèi),并設(shè)立對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)分組如下:①A組:單純?nèi)碚丈?TBI)組;②B組:淋巴瘤細(xì)胞白血病發(fā)病組;③C組:Allo-BMT組(異基因骨髓移植對(duì)照組);④D組:pXZ9-DC組:⑤E組:sTNFRⅠ-DC組。通過受鼠GVHD臨床評(píng)分、組織病理學(xué)、異基

4、因嵌合體、白血病的發(fā)病率、存活率、生存期及血清細(xì)胞因子水平等,觀察輸注sTNFRⅠ基因修飾的未成熟DC對(duì)異基因骨髓移植小鼠GVHD及GVL的影響。
　　 結(jié)果:
　　 ①小鼠骨髓單個(gè)核細(xì)胞在培養(yǎng)24 h后大部分貼壁生長(zhǎng),僅見少量懸浮細(xì)胞。第7 d的DC低表達(dá)ⅠA/ⅠE,CD86,LPS刺激的成熟DC高表達(dá)ⅠA/ⅠE、CD86,無論是成熟還是未成熟DC均高表達(dá)CD11c。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)兩種慢病毒對(duì)DC的感染率分別為54.5

5、8％以及46.67％,體外混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果提示sTNFRⅠ轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC刺激淋巴細(xì)胞的增殖能力較pXZ9轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC及LPS刺激的成熟DC減低(P＜0.05),pXZ9轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC較LPS刺激的成熟DC增殖力亦減低(P＜0.05)。Westem blot法檢測(cè)到含目的基因的病毒感染的DC中有sTNFRⅠ蛋白的表達(dá),而對(duì)照組未檢測(cè)到。
　　 ②A組10只TBI小鼠均于10 d內(nèi)死于骨髓衰竭;B組小鼠均死于淋巴瘤細(xì)胞白血病;C、D和E組

6、小鼠均有急性GVHD和白血病的發(fā)病,D組小鼠生存期較C組延長(zhǎng)(P＜0.05),E組小鼠生存期較C、D組延長(zhǎng)(P＜0.05),20％的小鼠生存期超過30 d。
　　 ③GVHD評(píng)分E組較C、D組降低(P＜0.05),D組較C組降低(P＜0.05)。
　　 ④B、C、D和E組小鼠均有白血病的發(fā)病,B組白血病發(fā)病率100％,較C、D和E組高,C、D、E各組問比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 ⑤移植后C、D和E組

7、小鼠IFN-γ、IL-2濃度逐漸升高,C組小鼠IL-4降低,而D、E組濃度升高,各組間比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 ⑥移植后18 d,C、D和E組小鼠異基因嵌合率達(dá)95％～100％。
　　 結(jié)論:
　　 ①經(jīng)含sTNFRⅠ的慢病毒感染未成熟DC后,sTNFRⅠ的蛋白穩(wěn)定地表達(dá),sTNFRⅠ可以維持DC于非成熟型狀態(tài);
　　 ②過繼輸注sTNFRⅠ基因修飾的未成熟DC延長(zhǎng)了異基因骨髓移植小鼠的