軟骨微粒復(fù)合仿生基質(zhì)溶膠體外構(gòu)建組織工程軟骨可行性研究.pdf

1、背景:關(guān)節(jié)軟骨損傷臨床發(fā)病率越來越高，正被人們高度關(guān)注。由于正常透明軟骨是一種特殊組織，無血管、神經(jīng)，損傷后其自我修復(fù)能力低下，直徑超過4mm的軟骨缺損不能完全自我修復(fù)。軟骨損傷后，會導(dǎo)致關(guān)節(jié)腫脹和疼痛，影響運動功能，不及時治療，最終發(fā)展為骨性關(guān)節(jié)炎。傳統(tǒng)治療關(guān)節(jié)軟骨缺損的方法有:微骨折技術(shù)、自體/異體骨軟骨移植技術(shù)等，但都存在一定的缺陷和不足。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，自體軟骨細胞移植(ACI)技術(shù)在臨床得到應(yīng)用，并取得明顯治療效果，但

2、還是存在明顯缺陷:首先軟骨細胞體外培養(yǎng)、擴增，難以模擬在體微環(huán)境，缺乏機體免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，植入的軟骨細胞通常已經(jīng)發(fā)生表型改變，最終形成的修復(fù)組織無論在結(jié)構(gòu)上還是成份上都與天然軟骨存在本質(zhì)差異，其次該方法需要二次手術(shù)植入修復(fù)缺損，治療期限跨度長，身體損傷大，給患者帶來巨大身體痛苦和經(jīng)濟負擔。
　　目的:本研究利用組織工程技術(shù)體外構(gòu)建組織工程軟骨，無菌條件下取貴州小香豬膝關(guān)節(jié)軟骨，制作成軟骨微粒，體外培養(yǎng)后觀察軟骨微粒中軟骨細胞脫落、

3、增殖情況，篩選最佳增殖效果的粒徑范圍，然后用增殖效果最佳的軟骨微粒作為種子細胞;制備Ⅱ型膠原蛋白、硫酸軟骨素、透明質(zhì)酸(COLⅡ/CS/HA)仿生基質(zhì)凝膠，加入EDAC交聯(lián)劑，升溫成凝膠后，檢測其成膠性能;用軟骨微粒與仿生基質(zhì)溶膠混合后體外共培養(yǎng)，通過大體和組織學(xué)檢測，評估體外構(gòu)建組織工程軟骨的可行性。本實驗成功后，可望為一次手術(shù)治療關(guān)節(jié)軟骨缺損提供依據(jù)。
　　方法:取3-5月齡貴州小香豬膝關(guān)節(jié)，把軟骨制成微粒狀;將微粒用孔徑分別

4、為120μm、212μm、475μm、880μm微粒篩過濾;收集不同粒徑的軟骨微粒，按粒徑由小至大設(shè)A、B、C、D組，保證每組質(zhì)量相同，均勻種植到3個12孔培養(yǎng)板中，用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng);培養(yǎng)1d、3d、7d時，分別取出1板進行細胞計數(shù)，篩選脫落、增殖效果最佳的粒徑范圍。用環(huán)鉆在離體新鮮豬膝關(guān)節(jié)上制備直徑8mm全厚軟骨缺損模型;將COLⅡ/CS/HA配制成終濃度10mg/ml復(fù)合仿生基質(zhì)溶膠，取3ml調(diào)至中性，加入EDAC20μl攪拌均勻;

5、用1ml注射器吸入中性復(fù)合膠并注入軟骨缺損模型，放入37℃孵箱，6min后觀察成凝膠情況;設(shè)計軟骨微粒獲取裝置，包括主機、刨頭、踏板;利用裝置獲取軟骨微粒在100-120μm之間，符合最佳增殖粒徑標準;COLⅡ/CS/HA按質(zhì)量比8∶1.5∶0.5溶于0.15mol/1HCL中，取3ml調(diào)至中性備用;軟骨微粒按5×104個/ml與COLⅡ/CS/HA溶膠混合，加入EDAC20μl攪拌均勻，注入軟骨缺損模型中，升溫6min成凝膠后，放入高

6、糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，1周后進行大體，免疫熒光和組織學(xué)觀察。
　　結(jié)果:制備的軟骨微粒即刻顯微鏡觀察軟骨細胞分布均勻，呈強折光性，可見部分軟骨陷窩被切開;培養(yǎng)1d各組微粒均有少量細胞脫落;3d時可見較多軟骨細胞從軟骨微粒中脫落、增殖;7d時大量軟骨細胞脫落、增殖，幾乎長滿板底，貼壁并呈長條狀。在3個時間點對各組軟骨細胞脫落、增殖情況計數(shù)，A組較B、C、D組軟骨細胞增殖好，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，最佳增殖粒徑為小于120μm的

7、軟骨微粒;制備的仿生基質(zhì)溶膠3ml，加入EDAC20μl交聯(lián)劑后低溫下呈溶膠狀，具有流動性，升溫一定時間后，變成凝膠狀，彈性、強度良好;軟骨微粒復(fù)合仿生基質(zhì)溶膠體外共培養(yǎng)1W，大體觀察見:外觀呈淡紅色，培養(yǎng)基充分浸入基質(zhì)中，觸之表面光滑并具有一定的彈性和強度;免疫熒光示:軟骨微粒中的軟骨細胞及脫落、增殖的軟骨細胞成活良好;HE染色示:軟骨微粒均勻分散于凝膠中，軟骨微粒中軟骨細胞存活良好;阿爾新蘭染色示:軟骨細胞從微粒中脫落、增殖并擴散至

8、周圍基質(zhì)中;天狼猩紅染色偏振光示:軟骨微粒與凝膠基質(zhì)融合良好，且成份基本相同。
　　結(jié)論:軟骨微粒體外培養(yǎng)完全可以存活，不同粒徑的軟骨微粒均有軟骨細胞脫落、增殖。證實粒徑小于120μm增殖效果最好，粒徑越小切開軟骨陷窩的機率大，細胞從微粒中脫落就多，此方法獲取的軟骨微粒作為組織工程軟骨種子細胞來源具有可行性;COLⅡ/CS/HA仿生基質(zhì)溶膠加入EDAC交聯(lián)劑后利用溫控相變原理，6min能夠由溶膠成凝膠，且凝膠彈性、強度好，具備植入