生物反應(yīng)器內(nèi)應(yīng)用富血小板血漿構(gòu)建血管化復(fù)合體修復(fù)骨壞死的研究.pdf

1、股骨頭缺血性壞死是由于各種病因破壞了股骨頭的血液供應(yīng)，造成的以股骨頭內(nèi)骨小梁和骨髓壞死為特征的臨床常見病，治療不及時可導(dǎo)致終生殘疾，是骨科醫(yī)生面臨的一大難題。骨壞死區(qū)的根本問題是成骨祖細(xì)胞和血管缺乏，壞死區(qū)域骨血管的形成是骨組織修復(fù)的前提，各國學(xué)者將研究點集中于如何促進骨壞死區(qū)骨小梁再生、新生血管形成。富血小板血漿(Platelet-rich plasma，PRP)是新鮮全血經(jīng)離心后獲取的自體血小板的濃縮體，含有多種高濃度的生長因子，包

2、括:血小板源性生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）、轉(zhuǎn)移生長因子（transforming growth factor，TGF-β）、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、類胰島素生長因子(insulin-like growth factor，IGF)、表皮生長因子(epidermal growth factor，EGF)等。本項

3、目擬將骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)與β-磷酸三鈣(β-TCP)在灌注式生物反應(yīng)器(bioreatctor，BO)內(nèi)復(fù)合三維培養(yǎng)，利用PRP的促血管生成、成骨作用，構(gòu)建高質(zhì)量的血管化復(fù)合體，在MRI實時導(dǎo)引下利用氬氦冷凍消融建立兔股骨頭壞死動物模型，同時在MRI導(dǎo)引下通過氬氦刀探針釘?shù)缹?gòu)建的血管化復(fù)合體精確置入到股骨頭骨壞死區(qū)，通過大體觀察、X線檢測、組織學(xué)評價觀察其促進骨壞死修復(fù)的作用

4、，期望為臨床治療早期股骨頭缺血性壞死提供新的治療方法。
　　1.MRI實時導(dǎo)引下氬氦冷凍消融建立新西蘭兔股骨頭缺血性壞死模型的實驗研究
　　目的：探討MRI實時導(dǎo)引下氬氦冷凍消融建立新西蘭兔股骨頭缺血性壞死模型的可行性和技術(shù)方法
　　方法：取2-3月齡的健康的新西蘭大白兔48只，靜脈麻醉成功后置于開放式0.23TMRI系統(tǒng)中，MRI導(dǎo)引下在大轉(zhuǎn)子下方1cm向股骨頭負(fù)重區(qū)打入2mm導(dǎo)引針，位置滿意后置入氬氦刀探針，左側(cè)實

5、驗組股骨頭氬氦冷凍消融2個循環(huán)20分鐘，右側(cè)股骨頭對照組氬氦冷凍消融1個循環(huán)10分鐘。分別于術(shù)后4周、8周、12周三個時間點行X線檢查、大體觀察和組織學(xué)觀察，評估股骨頭組織的壞死和修復(fù)情況。
　　結(jié)果：術(shù)后4、8、12周股骨頭組織學(xué)評估，實驗組1組股骨頭陷窩細(xì)胞分別是49.75±3.17，62.06±4.12，48.25±2.76，高于對照組2組39.13±4.48，50.69±3.84，37.50±3.86。術(shù)后8周實驗組陷窩細(xì)

6、胞率為62.06％。術(shù)后12周實驗組股骨頭塌陷率43.7％，對照組股骨頭塌陷率12.5％。
　　結(jié)論：MRI實時導(dǎo)引下利用氬氦冷凍消融成功的建立了兔股骨頭缺血性壞死模型，術(shù)后4周、8周、12周實驗組陷窩細(xì)胞率均明顯高于對照組。
　　2.灌注式生物反應(yīng)器應(yīng)用富血小板血漿構(gòu)建細(xì)胞-支架復(fù)合體體內(nèi)血管化評估
　　目的：灌注式生物反應(yīng)器內(nèi)應(yīng)用富血小板血漿構(gòu)建BMSCs-β-TCP復(fù)合體并評估其體內(nèi)血管化情況。
　　方法：

7、從兔耳緣靜脈抽取新鮮血液，采用二次離心法制備富血小板血漿，與低糖DMEM培養(yǎng)液制備全培養(yǎng)基。體外將兔骨髓間充質(zhì)細(xì)胞與β-磷酸三鈣陶瓷復(fù)合培養(yǎng)后植入到灌注式生物反應(yīng)器內(nèi)，定期更換全培養(yǎng)基，3周后取出復(fù)合體，進行掃描電鏡檢測。將各組不同方式培養(yǎng)的復(fù)合體植入到兔皮下組織內(nèi)，術(shù)后12周，取出復(fù)合體，免疫組織化學(xué)法檢測血管標(biāo)志物血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子（Clusterof Differentiation31，CD31）、第Ⅷ因子關(guān)連抗原(von

8、willebrand factor，vWF)的表達。
　　結(jié)果：實驗組電鏡掃描顯示β-磷酸三鈣(β-TCP)上可見有細(xì)胞粘附，細(xì)胞伸出偽足和β-磷酸三鈣(β-TCP)相連接，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞在β-TCP多孔陶瓷支架上的黏附、伸展和增殖良好。實驗組免疫組化結(jié)果顯示血管標(biāo)志物CD31、第Ⅷ因子關(guān)連抗原(VWF)呈強陽性表現(xiàn)，其他組CD31、vWF的表達較少。
　　結(jié)論：富血小板血漿富含多種細(xì)胞因子，灌注式生物反應(yīng)器內(nèi)應(yīng)用富血

9、小板血漿構(gòu)建細(xì)胞-支架復(fù)合體可以明顯促進復(fù)合體血管化。
　　3.灌注式生物反應(yīng)器內(nèi)構(gòu)建血管化BMSCs-β-TCP復(fù)合體修復(fù)骨壞死的實驗研究
　　目的：探討灌注式生物反應(yīng)內(nèi)構(gòu)建血管化BMSCs-β-TCP復(fù)合體促進骨壞死修復(fù)的作用。
　　方法：分別用實驗1、2描述的方法建立新西蘭兔股骨頭缺血性壞死模型和構(gòu)建血管化復(fù)合體。30只兔隨機分為六組，A組釘?shù)乐胁恢踩巳魏尾牧?，B組植入β-TCP支架，C組MSCs-β-TCP,D

10、組MSCs-β-TCP+bioreatctor,E組MSCs-β-TCP+PRP,F組MSCs-β-TCP+bioreactor+PRP。將不同方式構(gòu)建的BMSCs-β-TCP復(fù)合體沿股骨頭建模制作的釘?shù)乐踩氲焦晒穷^壞死區(qū)，術(shù)后12周利用大體觀察、X線檢查和組織學(xué)觀察評估其促進骨壞死修復(fù)的作用。
　　結(jié)果：術(shù)后12周，各組X線檢查示:A組、B組均有部分股骨頭骨皮質(zhì)不完整，局部骨密度高;C、D、E組未見有股骨頭明顯塌陷;F組未見有股