RNA干擾TERT基因促進脊髓修復(fù)的體外實驗研究.pdf

1、目的：構(gòu)建用于RNA干擾的靶向大鼠脊髓源星形膠質(zhì)細(xì)胞端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因的慢病毒載體，并觀察其對TERT表達(dá)和星形膠質(zhì)細(xì)胞生存的抑制作用。
　　方法：通過設(shè)計合成出shRNA-TER序列，經(jīng)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴增后定向連接到pLentilox3.7 U6載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒，經(jīng)轉(zhuǎn)染DH5α細(xì)胞篩選陽性菌落后行測序鑒定。將pLentilox3.7 U6-TERT重組質(zhì)粒和對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生重組慢病毒Le-TERT并測

2、定其滴度。用Le-TERT感染大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞，實時定量-聚合酶鏈反應(yīng)檢測各細(xì)胞株TERT基因表達(dá)水平，并利用Western blot和免疫熒光分別檢測TERT蛋白的表達(dá)，免疫熒光和流式細(xì)胞凋亡檢測觀察病毒干擾后對星形膠質(zhì)細(xì)胞的生存抑制作用。
　　結(jié)果：測序鑒定證明pLentilox3.7 U6-TERT重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,并成功包裝慢病毒。qRT-PCR結(jié)果表明：Le-TERT感染星形膠質(zhì)細(xì)胞后，對TERTmRNA的干擾效率可

3、達(dá)（63.98±2.6）％，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Western blot和免疫熒光檢測結(jié)果表明Le-TERT干擾組中星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TERT低表達(dá)，免疫熒光顯示Le-TERT病毒干擾組星形膠質(zhì)細(xì)胞生長受到抑制，流失細(xì)胞凋亡檢測證明干擾組星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡達(dá)到29.4%。
　　結(jié)論：構(gòu)建的重組表達(dá)載體pLentilox3.7 U6-TERT能夠產(chǎn)生有效滴度的慢病毒，感染大鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞后，該載體可以有效抑