CpG-ODN對鼠巨噬細胞TLR-9及Th1-Th2類細胞因子分泌的影響.pdf

1、背景：支氣管哮喘是由淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和肥大細胞等多種炎性細胞、炎癥介質和細胞因子共同參與的一種氣道慢性炎癥。免疫反應在哮喘的發(fā)病機制中占有重要地位。目前有人研究發(fā)現(xiàn)哮喘的發(fā)病的重要基礎是輔助性T細胞兩種亞型Th1和Th2細胞組成的比例和功能失衡。肺泡巨噬細胞可通過吞噬凋亡的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞等而有利于哮喘氣道炎癥的消退，同時也可通過釋放多種細胞因子和蛋白酶，參與哮喘免疫炎癥反應及氣道的修復和重構，為支氣管哮喘的重要效應細胞之

2、一。因此，研究巨噬細胞在支氣管哮喘發(fā)病機制中的作用，調控巨噬細胞功能可能為支氣管哮喘治療提供一個新思路。 CpG-ODN是含未甲基化的CpG二核苷酸的寡核苷酸序列，和細菌DNA一樣具有強烈的免疫刺激作用，能激活哺乳動物巨噬細胞、樹突狀細胞等多種免疫細胞。CpG-ODN還能誘導Th1細胞因子產生，抑制Th2細胞因子的釋放，誘導Th1反應，下調Th2反應，并使Th2反應向Th1反應轉變，使Th1/Th2免疫反應達到平衡的狀態(tài)。而調節(jié)

3、Th1/Th2平衡對哮喘的治療具有重要意義。其激活效應細胞途徑是通過Toll樣受體9 (Toll like-receptor，TLR-9) 介導的。TLR-9在識別CpG-ODN后，通過結構域募集髓樣分化因子(Myeloid differentiation factor88，MyD88)，核因子K B等多條信號途徑，啟動細胞活化進程，上調主要組織相容性復合物和共刺激分子表達等，進而誘導各種炎性細胞因子的表達。因此研究CpG-ODN與TL

4、R-9相互識別后對巨噬細胞細胞因子的分泌，TLR-9自身表達的影響，對于揭開CpG-ODN調控巨噬細胞功能的分子機制具有重要意義。 目的： (1) 從mRNA 和蛋白水平分析CpG-ODN 刺激鼠巨噬細胞后對鼠巨噬細胞TLR-9的表達。探討CpG-ODN調控巨噬細胞TLR-9表達的特征。 (2) 檢測CpG-ODN刺激前后巨噬細胞上清液中Th1類細胞因子TNF-a、IL-12及Th2類細胞因子IL-6的表達水平，

5、了解CpG-ODN刺激鼠巨噬細胞后對Th1/Th2類細胞因子分泌的影響。探討CpG-ODN調控巨噬細胞功能及TLR-9表達的分子機制。 方法： (1) 本研究采用體外培養(yǎng)小鼠單核-巨噬細胞系RAW264.7細胞，分別用CpG-ODN，Non-CpG-ODN，CpG-ODN +氯喹和培養(yǎng)基刺激巨噬細胞24小時，采用逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測并比較各組細胞TLR-9mRNA的表達情況，同時用免疫印跡法(Weste

6、rn blotting)進一步驗證TLR-9蛋白的表達。 (2) 放免法檢測各組巨噬細胞上清液中TNF-a、IL-6的表達水平。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組巨噬細胞上清液中IL-12的表達水平。 結果： (1) 刺激24小時后，CpG-ODN與CpG-ODN +氯喹組巨噬細胞上清中TLR-9mRNA的表達均顯著高于Non-CpG-ODN及對照組(p<0.05)，用Western blotting法進一步證

7、實了CpG-ODN與CpG-ODN +氯喹組巨噬細胞上清中TLR-9蛋白的表達較Non-CpG-ODN及對照組明顯增加(p<0.05)。 (2) 巨噬細胞上清液中TNF-a水平CpG-ODN組明顯高于其他組，差異有顯著性(P<0.05)。而各組巨噬細胞上清液中IL-6，IL-12水平無顯著性差異(p>0.05)。 結論： CpG-ODN 刺激鼠巨噬細胞24小時后可引起鼠巨噬細胞TLR-9無論在蛋白水平還是在核酸水