ER亞型對(duì)MCF-7的生物學(xué)特性及其分泌Th1-Th2類細(xì)胞因子的影響.pdf

1、目的:
　　以人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7作為親本細(xì)胞，采用siRNA干擾技術(shù)構(gòu)建不同雌激素受體(ER)亞型ERα/ERβ的穩(wěn)定表達(dá)株，探討不同ER亞型對(duì)MCF-7的生物學(xué)特征及其分泌Th1/Th2類細(xì)胞因子的影響。
　　方法:
　　本實(shí)驗(yàn)以ERα和ERβ穩(wěn)定表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7為親本細(xì)胞株。以pGenesil-1質(zhì)粒為載體，將針對(duì)ERα或ERβ的siRNA經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染導(dǎo)入MCF-7，沉默ERα或ERβ基因，建立

2、不同ER亞型的穩(wěn)定表達(dá)株，并命名為:M/HK（ERαhigh/ERβhigh，陰性對(duì)照）、M/siα（ERαlow/ERβhigh）及M/siβ(ERαhigh/ERβlow)。以此為基礎(chǔ)，做如下實(shí)驗(yàn):
　　1.采用Western blot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效果。
　　2.采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　3.采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。
　　4.利用二步法RT-PCR檢測(cè)凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl

3、-x1和XIAP的表達(dá)情況。
　　5.采用雙層軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞體外成瘤能力。
　　6.采用細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的黏附能力。
　　7.采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)IFN-γ和IL-4的分泌情況。
　　結(jié)果:
　　1.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，M/siα和M/siβ細(xì)胞ERα或ERβ的最高干擾效率為77.7％和68.3％，而M/HK細(xì)胞ER表達(dá)水平?jīng)]有變化。說(shuō)明成功構(gòu)建了ERα/ERβ不

4、同表達(dá)的人乳腺癌細(xì)胞株。
　　2.MTT分析結(jié)果顯示，經(jīng)24h、48h培養(yǎng)，M/siα細(xì)胞(0.55±0.008，0.60±0.008)和M/siβ細(xì)胞（0.58±0.008，0.69±0.001）的增殖活性與M/HK細(xì)胞（0.56±0.004，0.63±0.002）相比無(wú)顯著差異（P＞0.05）;經(jīng)72h、96h培養(yǎng)，M/siα細(xì)胞（0.71±0.098，0.81±0.087）的增殖活性與M/HK細(xì)胞（0.88±0.145，1.

5、07±0.156）相比降低(P＜0.01)，M/siβ細(xì)胞（1.01±0.086，1.23±0.124）的增殖活性增強(qiáng)(P＜0.01)。
　　3.流式檢測(cè)結(jié)果顯示，與M/HK細(xì)胞相比，M/siα細(xì)胞G0～G1期細(xì)胞比例增多（52.75±3.43％vs65.25±2.08％，P=0.015），S期所占比例顯著減少（31.04±1.39％vs15.90±1.52％，P＜0.01），G2～M期所占比例無(wú)顯著變化（16.21±2.64％v

6、s18.86±1.20％，P＞0.05）;而M/siβ細(xì)胞G0～G1期比例降低（52.75±3.43％vs40.56±6.67％，P=0.017），S期所占比例升高（31.04±1.39％vs43.16±4.67％，P＜0.01），G2～M期所占比例無(wú)顯著變化(16.21±2.64％vs16.28±2.00％，P＞0.05)。
　　4.半定量RT-PCR結(jié)果顯示，M/siα細(xì)胞凋亡抑制基因XIAP的表達(dá)水平降低，為M/HK細(xì)胞的0

7、.43倍(P＜0.01);M/siβ細(xì)胞凋亡抑制基因Bcl-2、Bcl-x1及XIAP的水平升高，為M/HK細(xì)胞的1.28倍、1.61倍及1.65倍(P＜0.01)。
　　5.雙層軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與M/HK細(xì)胞相比，M/siα細(xì)胞的集落形成數(shù)目減少（50.13±3.78vs21.25±2.63，P＜0.01），為M/HK細(xì)胞的0.43倍;M/siβ細(xì)胞的集落形成數(shù)目增多（50.13±3.78vs67.85±7.32，P

8、＜0.01），為M/HK細(xì)胞的1.36倍。
　　6.細(xì)胞黏附實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，讀取各組細(xì)胞570nm處的吸光度（A）值，與M/HK細(xì)胞相比，M/siα細(xì)胞的體外黏附能力下降（0.70±0.08vs0.48±0.09，P＜0.01）;M/siβ細(xì)胞的體外黏附能力無(wú)顯著變化（0.70±0.08vs0.65±0.12，P＞0.05）。
　　7.ELISA結(jié)果顯示，與M/HK細(xì)胞相比，M/siα細(xì)胞IFN-γ的分泌水平增強(qiáng)（54±2pg

9、/mL vs10.2±8pg/mL，P＜0.01），M/siβ細(xì)胞降低（54±2pg/mL vs15±1pg/mLP＜0.01）;各細(xì)胞IL-4的分泌水平?jīng)]有明顯變化（M/HK38±4pg/mL，M/siα42±8pg/mL，M/siβ44±7pg/mL，P＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.ERα/ERβ不同表達(dá)會(huì)影響MCF-7的生物學(xué)特性。ERα過(guò)表達(dá)可促進(jìn)MCF-7的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移;而ERβ過(guò)表達(dá)則可抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。