嗅鞘細(xì)胞對螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞離體培養(yǎng)的影響及其機制的研究.pdf

1、第一部分:嗅鞘細(xì)胞的體外培養(yǎng)、純化及鑒定
　　目的:純化培養(yǎng)和鑒定成年大鼠嗅球嗅鞘細(xì)胞(olfactoryensheathingcellsOECs),為后續(xù)實驗做好準(zhǔn)備。方法:取成年大鼠嗅球神經(jīng)層,經(jīng)酶消化的方法獲得含有OECs的混合細(xì)胞懸液,采用多次長時差速貼壁的方法純化OECs,用含有10％:FBS的DF12培養(yǎng)基培養(yǎng),2d后培養(yǎng)基中加入bFGF(20ng/ml)和forskolin(2uM)促進OECs的增殖,每隔3d半量更

2、換培養(yǎng)基。倒置相差顯微鏡下觀察OECs的生長狀態(tài),采用P75NTR和GFAP細(xì)胞免疫組化的方法鑒定OECs,熒光顯微鏡下觀察OECs的形態(tài)并統(tǒng)計其純度。結(jié)果:采用多次長時差速貼壁的方法能夠去除絕大部分的污染細(xì)胞,包括成纖維細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞,接種的OECs約24小時后貼壁,倒置相差顯微鏡下觀察見大部分細(xì)胞胞體呈梭形、部分細(xì)胞胞體為多角形,伸出突起;細(xì)胞在接種培養(yǎng)的前2d生長緩慢,2d后培養(yǎng)基中加入bFGF(20ng/ml)和forsko

3、lin(2uM)可見細(xì)胞增殖加快,細(xì)胞突起細(xì)長,培養(yǎng)7d后見OECs覆蓋皿底的90％,形成一細(xì)胞單層。P75NTR和GFAP染色見約92％的細(xì)胞為P75grR(+),分布在突起、胞體,其中胞核被深染;約12％的細(xì)胞為GFAP(+)。結(jié)論:采用多次長時差速貼壁的方法能夠獲得實驗所需純度的OECs,培養(yǎng)基(DFl2+10％FBS)中加入bFGF(20ng/ml)和forskolin(2uM)能夠顯著促進OECs的增殖。
　　第二部分:

4、嗅鞘細(xì)胞對耳蝸螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞離體培養(yǎng)的影響
　　目的:探索在離體實驗中OECs有無促進耳蝸聽覺傳入神經(jīng)元—螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(spiralganglioncellsSGCs)存活的作用。方法:取成年大鼠嗅球和新生大鼠蝸軸組織塊進行OECs與SGCs的培養(yǎng),采用多次長時差速貼壁的方法純化培養(yǎng)OECs。實驗分OECs與SGCs共培養(yǎng)組、SGCs在OECs條件培養(yǎng)液中(OEC-CM)培養(yǎng)組和SGCs單獨培養(yǎng)組。倒置相差顯微鏡下觀察OECs和

5、SGCs生長狀態(tài),P75NTR免疫組化法鑒定OECs,神經(jīng)元特異性標(biāo)志物βⅢ-tubulin標(biāo)記SGCs。結(jié)果:OECs貼壁培養(yǎng)7天后形成一細(xì)胞單層,在OECs與SGCs共培養(yǎng)體系中,SGCs在OECs形成的細(xì)胞單層的表面生長,并伸出長突起,呈現(xiàn)典型的雙極神經(jīng)元形態(tài);在培養(yǎng)的前6d,隨著培養(yǎng)時間的延長,SGCs較接種前減少,但共培養(yǎng)組中SGCs存活數(shù)量明顯高于SGCs單獨培養(yǎng)組(P＜0.01);與SGCs在OEC-CM中培養(yǎng)比較,共培養(yǎng)

6、組更能促進SGCs存活,并且單獨培養(yǎng)組的SGCs數(shù)量在培養(yǎng)的第6d出現(xiàn)大幅度減少;在培養(yǎng)的第9d,單獨培養(yǎng)組中幾乎沒有SGCs生長;而在共培養(yǎng)組,SGCs的數(shù)量未見明顯變化(P＞0.05);統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)單獨培養(yǎng)組中存活的SGCs由第3d的14.6±1.1SGCs/視野(×200)減少到第14d的3.3±0.3SGCs/視野;OEC-CM組中的SGCs由35.3±2.1SGCs/視野下降到12.9±0.3SGCs/視野;共培養(yǎng)組中存活的SGC

7、s較其它組明顯增多,由第3d的66.9±1.2SGCs/視野(×200)減少到第14d的38.9±1.0SGCs/視野。結(jié)論:OECs與SGCs共培養(yǎng)能夠促進新生大鼠SGCs存活。
　　第三部分:嗅鞘細(xì)胞促進螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活的分子機制
　　目的:初步研究OECs促進SGCs體外存活的分子機制。方法:建立OECs與SGCs共培養(yǎng)體系,實驗分三組:共培養(yǎng)+腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(BDNF,500pg/ml)組:共培養(yǎng)+BDNF抗體

8、(IgY型,50ug/ml)組:對照組為OECs與SGCs共培養(yǎng)。共培養(yǎng)3d后固定,βⅢ-tubulin免疫組化染色鑒定SGCs,每個培養(yǎng)皿隨機取4個視野,熒光顯微鏡下統(tǒng)計βⅢ-tubulin標(biāo)記的SGCs,統(tǒng)計各培養(yǎng)組中的SGCs。結(jié)果:共培養(yǎng)+BDNF組中有大量SGCs在OECs形成的單層細(xì)胞毯表面生長,但與對照組比較,SCG的數(shù)目無統(tǒng)計學(xué)差異;加入BDNF抗體(lgY)的共培養(yǎng)組中的SGCs數(shù)量明顯減少(P＜0.01)。結(jié)論:OE