Otos基因?qū)樸K損傷大鼠耳蝸螺旋韌帶成纖維細(xì)胞的保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景與目的： 順鉑是一類廣泛應(yīng)用于臨床腫瘤治療的細(xì)胞毒性藥物，其腎毒性和耳毒性副作用嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，隨著腫瘤耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)，順鉑的化療用量逐漸加大，毒副作用也愈加明顯，由于化療前水化和利尿劑的使用，腎毒性副作用已得到有效預(yù)防，因而對(duì)其耳毒性的防治成為一項(xiàng)亟待解決的課題。國(guó)內(nèi)外嘗試用藥物保護(hù)受損的內(nèi)耳細(xì)胞，但由于血迷路屏障的存在，藥物到達(dá)內(nèi)耳的有效濃度不高，療效受限，新的防治方法亟待探索。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過(guò)將特異性基

2、因轉(zhuǎn)入內(nèi)耳細(xì)胞中持久表達(dá)以拮抗順鉑的毒性作用，取得較好效果，基因治療已成為目前研究的熱點(diǎn)。 位于耳蝸外側(cè)壁的螺旋韌帶因?yàn)橛砷g質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成一直未受到重視，近年研究發(fā)現(xiàn)，螺旋韌帶參與構(gòu)成血迷路屏障，是內(nèi)耳鉀離子循環(huán)的樞紐，表達(dá)多種基因，如Cx26，Cx30，Cx31，Cx43，COCH以及Pendrin等，這些基因的異?？梢詫?dǎo)致聽(tīng)力損失，因此螺旋韌帶的功能在耳科學(xué)研究中逐步成為熱點(diǎn)。Otos是一種新發(fā)現(xiàn)的特異性表達(dá)于螺旋韌帶成纖維細(xì)胞

3、(SpiralLigament:Fibrocytes，SLFs)上的特殊基因，它的表達(dá)缺失可以導(dǎo)致耳聾，推測(cè)它可能具有保護(hù)螺旋韌帶成纖維細(xì)胞和維護(hù)耳蝸內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用。但Otos在順鉑耳毒性病理過(guò)程中的作用和機(jī)制尚不清楚，本研究擬通過(guò)上調(diào)SLFs的Otos表達(dá)，探測(cè)Otos對(duì)SLFs順鉑損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。 研究方法: 1、原位雜交法檢測(cè)大鼠耳蝸OtosmRNA的表達(dá)。 2、大鼠SLFs的原代培養(yǎng)和SLFs

4、類型的免疫熒光鑒定。 3、設(shè)計(jì)和構(gòu)建表達(dá)大鼠Otos的腺病毒表達(dá)載體。應(yīng)用RT-PCR技術(shù)由體外培養(yǎng)的大鼠SLFs總RNA中克隆出Otos基因，將Otos基因定向克隆到穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV上，經(jīng)與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸埃希菌BJ5183內(nèi)同源重組后，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞進(jìn)行包裝，并反復(fù)感染293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)其進(jìn)行滴度及活性等檢測(cè)。 4、用構(gòu)建好的腺病毒載體轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的SLFs，確定其最佳感染復(fù)數(shù)(

5、Multiplicityofinfection，MOI)和感染時(shí)間。 5、用腺病毒載體的最佳感染復(fù)數(shù)和感染時(shí)間感染SLFs后，將細(xì)胞分兩大組，每組含3種細(xì)胞，即SLFs-AdOtos(含GFP)、SLFs-AdGFP和SLFs-nontransfection,兩個(gè)大組分別用20μM順鉑或DMEM作用12h后，用MTT和TUNEL法分別檢測(cè)細(xì)胞活力和凋亡情況，用RT-PCR檢測(cè)OtosmRNA的表達(dá)，免疫印跡檢測(cè)JNK、p-JNK

6、、ERK、p-ERK、p38、p-p38、bcl-2、bax、caspase-3蛋白的表達(dá)。 6、將Ad-Otos轉(zhuǎn)染的SLFs分5組，其中3組分別用JNK抑制劑SP600125、ERK抑制劑PD98059、p38抑制劑SB203580預(yù)處理后，用20μM順鉑作用細(xì)胞，另2組分別用20μM順鉑或DMEM處理作為對(duì)照，MTT和TUNEL法分別檢測(cè)細(xì)胞活力和凋亡情況，免疫印跡檢測(cè)bcl-2、bax和caspase-3的蛋白表達(dá)。

7、 結(jié)果： 1、原位雜交法顯示大鼠耳蝸螺旋韌帶上有OtosmRNA的表達(dá)。 2、成功培養(yǎng)并純化大鼠SLFs，免疫熒光鑒定為I型SLFs。 3、成功構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體Ad-Otos，經(jīng)過(guò)293細(xì)胞大量擴(kuò)增，獲得病毒滴度約7x109pfu/ml。 4、經(jīng)過(guò)用Ad-Otos轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的SLFs后，測(cè)得最適MOI為50。 5、單純轉(zhuǎn)染Ad-Otos后的SLFs，其細(xì)胞活力和凋亡無(wú)明顯變化，對(duì)MAPKs和線

8、粒體凋亡途徑無(wú)明顯影響。 6、順鉑損傷后，和對(duì)照細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染Ad-Otos的SLFs活力增加，凋亡減少，伴有JNK途徑的抑制、ERK途徑的活化和線粒體凋亡途徑的抑制。 7、應(yīng)用信號(hào)途徑抑制劑，提示Otos對(duì)細(xì)胞的保護(hù)過(guò)程可能通過(guò)抑制JNK并活化ERK而實(shí)現(xiàn)；線粒體凋亡途徑可能受MAPKs信號(hào)通路調(diào)節(jié)。 結(jié)論：上調(diào)Otos基因的表達(dá)對(duì)順鉑損傷的SLFs可能具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過(guò)抑制JNK、活化ERK及抑制線