P2Y2受體對(duì)大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元介導(dǎo)瞬時(shí)外向鉀電流的電壓門控性鉀通道的抑制作用研究.pdf

1、[研究目的]
　　 慢性疼痛的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)接近20％～25％。目前的治療方法無法使大部分慢性疼痛患者解除痛苦。因此，有必要探尋治療慢性疼痛的新方法，這會(huì)使很多患者改善生活質(zhì)量。三叉神經(jīng)痛(trigeminalneuralgia，TN)是一種三叉神經(jīng)分布區(qū)域中的反復(fù)的刀刺般劇痛的疾病。這種發(fā)作存在扳機(jī)點(diǎn)，特別在說話、咀嚼、刷牙、剃須以及輕觸時(shí)，甚至涼風(fēng)也能引起。這種發(fā)作常常是單側(cè)的，一天之內(nèi)可能重復(fù)出現(xiàn)，非常痛苦。然而由于其

2、發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，到目前為止，臨床上仍缺乏滿意地鎮(zhèn)痛藥物。TN發(fā)作時(shí)三叉神經(jīng)軸上各級(jí)神經(jīng)元(三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和三叉神經(jīng)感覺主核、脊束核、下丘腦、大腦皮層的神經(jīng)元)興奮性提高，易化性增強(qiáng)，痛覺閾值降低。這種興奮性的提高導(dǎo)致在受到輕微刺激或無刺激時(shí)，神經(jīng)元陣發(fā)性大幅度放電，傳入中樞引起劇痛。但是這些神經(jīng)元興奮性的極度提高和大幅度放電的形成原因是什么，尚需進(jìn)一步研究。P2受體是病理性疼痛傳遞中的關(guān)鍵蛋白，可以被外周傷害性刺激激活，引起背根

3、神經(jīng)節(jié)(dorsalrootganglion，DRG)神經(jīng)元或者TG神經(jīng)元細(xì)胞膜去極化。Kv通道由于參與動(dòng)作電位的調(diào)節(jié)而成為疼痛治療的潛在的靶標(biāo)。最近有報(bào)道稱選擇性的Kv7通道的開放劑(retigabine)可以選擇性地降低傷害性感受傳入纖維的興奮性。在三叉神經(jīng)病理性疼痛或者炎性痛模型中，KV通道介導(dǎo)的IA和Ik與正常大鼠相比顯著降低。由于IA和Ik在神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏陌l(fā)生頻率和間期的調(diào)節(jié)中起到了重要的作用。因而本實(shí)驗(yàn)擬利用痛覺行為學(xué)，電

4、生理學(xué)和分子生物學(xué)等方法探討P2受體對(duì)KV通道的調(diào)節(jié)及機(jī)制，研究參與調(diào)節(jié)IA通道的P2受體亞型及其中的途徑，從而尋找三叉神經(jīng)病理性痛相關(guān)的靶點(diǎn)，為臨床治療提供理論依據(jù)。
　　 [研究方法]
　　 1、動(dòng)物分組：①正常SD雄性大鼠200～250g，隨機(jī)分組進(jìn)行免疫組化雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)：熒光金(FG)和P2Y2；P2Y2與Kv1.4：P2Y2與Kv3.4；P2Y2與Kv4.2；P2Y2與Kv4.3。正常SD雄性大鼠80～120g，培

5、養(yǎng)TG神經(jīng)元隨機(jī)分組，分別給予UTP/ATP，Surmain和U0126等藥物處理。②ION-CCI大鼠：SD雄性大鼠200～250g，隨機(jī)分為假手術(shù)組和手術(shù)組。
　　 2、實(shí)驗(yàn)方法：①大鼠ION-CCI術(shù)；②經(jīng)眶下孔達(dá)TG目標(biāo)注射給藥法；③大鼠痛覺行為學(xué)測(cè)定；④三叉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞分離培養(yǎng)；⑤免疫熒光組織化學(xué)方法和細(xì)胞免疫熒光化學(xué)方法；⑥P2Y2反義寡核苷酸干擾方法；⑦實(shí)時(shí)定量RT-PCR；⑧Westernblotting；⑨細(xì)胞電

6、生理記錄。
　　 [結(jié)果]
　　 一、正常大鼠
　　 1、ATP對(duì)TG神經(jīng)元快速作用：電生理結(jié)果顯示，在培養(yǎng)的大鼠TG神經(jīng)元上給予ATP后，①產(chǎn)生T型ATP電流的TG神經(jīng)元IA被抑制，IA峰電流從(4.18±0.63)nA(n=14)減小到(1.34±0.22)nA(n=13)，(P<0.05，pairedt-test)；②產(chǎn)生S型ATP電流的TG神經(jīng)元IA無顯著影響；③部分ATP不敏感型TG神經(jīng)元IA也受到抑制

7、。
　　 2、免疫熒光組化方法顯示：P2Y2受體與介導(dǎo)IA的Kv通道亞型Kv1.4，Kv3.4，Kv4.2以及Kv4.3分別高比率地共同表達(dá)在TG神經(jīng)元上。
　　 3、ATP對(duì)TG神經(jīng)元長(zhǎng)時(shí)程作用：①電生理結(jié)果顯示，激活的P2Y2受體降低大鼠TG神經(jīng)元產(chǎn)生動(dòng)作電位的閾電流：147.1±32.9pA變?yōu)?8.3±10.3pA(control：n=7；UTP：n=9，**P<0.01)，增加動(dòng)作電位數(shù)目(control：1.

8、3±0.9spikes/400ms，n=3；UTP：10.8±3.5spikes/400ms，n=4，*P<0.05)；②電生理結(jié)果顯示，激活的P2Y2受體對(duì)IA的抑制作用可被選擇性P2Y2受體阻斷劑Suramin阻斷(control：0.14±0.01nAvsUTP：0.09±0.01pA.n=20,P<0.05；Suramin：0.13±0.01pA，n=9，P>0.05vscontrol)；③電生理結(jié)果顯示，激活的P2Y2受體對(duì)I

9、A的抑制作用可被ERK拮抗劑U0126阻斷(Control：0.14±0.01nAvsUTP：0.09±0.01pA，n=20,P<0.05；U0126：0.15±0.03pA，n=11，P>0.05vscontrol)：④實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果顯示，激活的P2Y2受體顯著抑制Kv1.4，Kv3.4，Kv4.2以及Kv4.3的mRNA表達(dá)。
　　 二、ION-CCI大鼠
　　 1、免疫熒光組化方法顯示：ION-CCI術(shù)

10、后，大鼠P2Y2受體陽性的神經(jīng)元表達(dá)Kv1.4，Kv3.4.Kv4.2以及Kv4.3顯著減少。
　　 2、ION-CCI大鼠，經(jīng)眶下孔達(dá)TG目標(biāo)注射給藥法給予Suramin，其觸須墊部位機(jī)械痛閾呈劑量依賴性恢復(fù)(saline：0.96±0.4gn=8，Suramin0.3:11.45±2.4gn=7，Suramin3：29.96±4.1gn=6，**P<0.01；##P<0.01vsSuramin0.3)，維持45min。

11、>　　 3、ION-CCI大鼠，經(jīng)眶下孔達(dá)TG目標(biāo)注射給藥法給予P2Y2反義寡核苷酸(P2Y2受體下調(diào))，其觸須墊部位機(jī)械痛閾顯著恢復(fù)(saline：0.49±0.1gn=7；antisense：49.54±8.0gn=5.P<0.001)，維持120h。
　　 4、ION-CCI大鼠，經(jīng)眶下孔達(dá)TG目標(biāo)注射給藥法給予P2Y2反義寡核苷酸(P2Y2受體下調(diào))，ION-CCI大鼠TG神經(jīng)元Kv1.4，Kv3.4，Kv4.2mRN

12、A表達(dá)顯著增加。
　　 5、ION-CCI大鼠，經(jīng)眶下孔達(dá)TG目標(biāo)注射給藥法給予P2Y2反義寡核苷酸(P2Y2受體下調(diào))，大鼠TG神經(jīng)元中pERK的蛋白表達(dá)顯著降低。
　　 [結(jié)論]
　　 在大鼠三又神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，P2Y2受體可能通過ERK途徑，下調(diào)TG神經(jīng)元Kv1.4、Kv3.4和Kv4.2表達(dá)，進(jìn)而提高TG神經(jīng)元興奮性。P2Y2受體下調(diào)可顯著逆轉(zhuǎn)ION-CCI大鼠面部痛覺過敏。這些結(jié)果提示控制P2Y2受體的表