Src-家族酪氨酸激酶在皮質(zhì)性白內(nèi)障中對(duì)Na,K-ATP酶的影響.pdf

1、研究背景
　　Na,K-ATP酶在維持晶狀體內(nèi)鈉、水、糖的正常轉(zhuǎn)運(yùn)、保持晶狀體透明中起著重要的作用，研究證明Na,K-ATP酶可作為Src-家族酪氨酸激酶（SFK）的底物而被磷酸化，從而引起它們活性和功能的變化。研究表明鈉離子濃度升高與皮質(zhì)性年齡相關(guān)性白內(nèi)障密切相關(guān)，我們的前期研究也發(fā)現(xiàn)，SFK的異常激活參與皮質(zhì)性白內(nèi)障的發(fā)生，因此必要研究白內(nèi)障發(fā)生中SFK與Na,K-ATP酶之間的作用關(guān)系。
　　目的
　　利用Src

2、-家族酪氨酸激酶抑制劑PP1，觀察它對(duì)體外培養(yǎng)的雞胚白內(nèi)障模型的晶狀體中Na,K-ATP酶及其活性的影響，探討SFK與Na,K-ATP酶之間的作用對(duì)白內(nèi)障發(fā)生的影響。
　　方法
　　用孵化10天的雞胚全晶狀體作體外培養(yǎng)，用培養(yǎng)在M199和10％胎牛血清晶狀體作為對(duì)照，另外加入10uMSrc-家族酪氨酸激酶抑制劑PP1培養(yǎng)的晶狀體為實(shí)驗(yàn)組（或PP1組）。取胚胎第10天（E10）晶狀體作為正常對(duì)照，在培養(yǎng)的第5天和第10天分別取

3、出兩組的晶狀體進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)：制備冰凍切片，進(jìn)行Na,K-ATP酶α1亞基、c-Src的免疫熒光染色；將晶狀體顯微分離成晶狀體上皮部（E）、周邊部纖維（FP）和中央部纖維（FC）三部分，利用用于WesternBlot和RT-PCR檢測(cè)晶狀體中Na,K-ATP酶α1亞基蛋白和mRNA表達(dá)的變化，通過(guò)檢測(cè)烏本苷敏感的ATP水解率測(cè)定Na,K-ATP酶的活性。另外，收集白內(nèi)障手術(shù)患者的晶狀體前囊膜，進(jìn)行Na,K-ATP酶α1亞基的免疫熒光染色，

4、觀察不同年齡組酶表達(dá)的變化。
　　結(jié)果
　　Na,K-ATP酶α1亞基蛋白在白內(nèi)障患者的晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)隨著年齡增長(zhǎng)而減弱。免疫熒光染色和WesternBlot檢測(cè)均顯示，在正常胚胎雞晶狀體上Na,K-ATP酶α1亞基在晶狀體上皮細(xì)胞的表達(dá)最強(qiáng)，其次是表層晶狀體纖維，中央部纖維的表達(dá)最弱；Na,K-ATP酶活性分布特征與α1亞基蛋白的分布特征一致。利用免疫熒光染色、WesternBlot和RT-PCR檢測(cè)均顯示，在培養(yǎng)的

5、第5、10天，PP1處理的晶狀體Na,K-ATP酶α1亞基的分布特征沒(méi)有變化，但其表達(dá)量卻強(qiáng)于對(duì)照組；PP1處理后Na,K-ATP酶活性比對(duì)照組降低。
　　結(jié)論
　　在晶狀體中Na,K-ATP酶α1亞基的表達(dá)在晶狀體上皮細(xì)胞、表層纖維和中央部纖維依次減弱，Na,K-ATP酶的活性分布特征與酶的分布特征一致。Src-家族酪氨酸激酶特異性抑制劑PP1降低實(shí)驗(yàn)性皮質(zhì)性白內(nèi)障的混濁面積，不是通過(guò)增強(qiáng)Na,K-ATP酶的活性，而是增強(qiáng)