Na-K-ATP酶α1亞基對(duì)偶聯(lián)蛋白Src功能的調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、ATP偶聯(lián)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅具有轉(zhuǎn)運(yùn)離子和代謝產(chǎn)物的功能，近年來已被證明同時(shí)具有傳遞細(xì)胞信號(hào)的功能，具有與G偶聯(lián)蛋白受體相似的功能和機(jī)制，是重要的藥物靶標(biāo)群。本研究主要對(duì)一個(gè)重要的P型ATP偶聯(lián)膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白—Na/K-ATP酶的功能亞基α1如何調(diào)節(jié)偶聯(lián)Src蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能進(jìn)行了闡述，以便深入探討其作為藥物治療靶標(biāo)的多重性。
　　 鈉鉀ATP酶（Na/K-ATPase），又稱鈉泵，其α1亞基(α1Na/K-ATPase)擁有離

2、子轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳導(dǎo)的雙重功能。在上皮細(xì)胞中，α1Na/K-ATPase能和Src激酶形成受體復(fù)合物，此受體復(fù)合物在ouabain刺激下能激活Src激酶，并且體外實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明這個(gè)Src的激活作用是跟α1Na/K-ATPase的構(gòu)象轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的。強(qiáng)心苷類藥物作用于Na/K-ATPase時(shí)同時(shí)影響了這兩個(gè)功能，這也是其毒副作用的來源。而到目前為止對(duì)Na/K-ATPase的一個(gè)研究瓶頸是我們無法將細(xì)胞內(nèi)Na/K-ATPase的離子轉(zhuǎn)運(yùn)和信號(hào)傳導(dǎo)

3、功能分開。
　　 本論文利用基因點(diǎn)突變法構(gòu)建了一個(gè)新的突變?chǔ)?Na/K-ATPase，它仍保留了Na/K-ATPase的離子泵功能，但是喪失了對(duì)Src蛋白及其下游信號(hào)通路的調(diào)控作用。已報(bào)道在體外實(shí)驗(yàn)中鑒定出α1Na/K-ATPaseN端的Naktide（S415到Q434）是和Src蛋白激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合的部位，其中Naktide能結(jié)合并抑制Src活性。而本論文在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究了Naktide和Src結(jié)合的分子機(jī)制。首先通過體外

4、脯氨酸突變Naktide（脯氨酸替代丙氨酸能剖壞螺旋結(jié)構(gòu)）和Src激酶活性實(shí)驗(yàn)證明破壞Naktdie的螺旋結(jié)構(gòu)后，Naktide不在有效抑制Src活性；再次，在細(xì)胞中表達(dá)A420P突變的α1Na/K-ATPase后，細(xì)胞內(nèi)Src活性顯著增加，配體ouabain不能再通過α1來激活Src蛋白，并且經(jīng)測(cè)定此突變不影響α1的離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性和構(gòu)象轉(zhuǎn)化功能。
　　 本論文還創(chuàng)建了一對(duì)構(gòu)象轉(zhuǎn)化缺陷的細(xì)胞株，進(jìn)一步從細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明了α1Na/K-

5、ATPase自身構(gòu)象轉(zhuǎn)化對(duì)動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Src活性的重要作用。已經(jīng)報(bào)道經(jīng)過純化的Na/K-ATPase體外實(shí)驗(yàn)，證實(shí)α1對(duì)Src的調(diào)控是具有構(gòu)象依賴性的，即在E1構(gòu)象時(shí)，α1結(jié)合并抑制Src活性；而在ouabain結(jié)合的E2構(gòu)象時(shí)，Src被激活。本論文則進(jìn)一步從細(xì)胞水平研究這個(gè)α1蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)化對(duì)結(jié)合Src并調(diào)控其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。首先采用點(diǎn)突變法創(chuàng)建了I279A（細(xì)胞內(nèi)α1多數(shù)停滯在E1構(gòu)象，叫做E1樣細(xì)胞）和F286A（細(xì)胞內(nèi)α1多數(shù)停

6、滯在E2構(gòu)象，叫做E2樣細(xì)胞）這一對(duì)構(gòu)象轉(zhuǎn)化缺陷的細(xì)胞系。跟體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，在E1樣時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Src活性被抑制，而在E2樣時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Src活性顯著高于E1樣細(xì)胞。并且在這兩個(gè)細(xì)胞內(nèi)，ouabain都不能再激活Src，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)這個(gè)α1構(gòu)象轉(zhuǎn)化缺陷對(duì)Src信號(hào)的影響是特異性的，因?yàn)樗桓淖僶uabain引起的Akt信號(hào)變化。
　　 綜上所述，本論文首次創(chuàng)建了兩組細(xì)胞模型，一組是A-P突變?chǔ)?，其中的典型模型A420P突變?chǔ)?，

7、在細(xì)胞水平，它仍然有完好的離子泵功能，但是不能調(diào)控Src蛋白及其下游信號(hào)通路。這證實(shí)了Naktide的螺旋結(jié)構(gòu)在結(jié)合并調(diào)控Src過程中的重要性。另一組模型是α1構(gòu)象轉(zhuǎn)化缺陷型細(xì)胞。從細(xì)胞水平，我們認(rèn)識(shí)到α1構(gòu)象轉(zhuǎn)化的這種動(dòng)態(tài)平衡對(duì)于α1調(diào)節(jié)Src活性及其下游信號(hào)通路具有重要意義。這些新的突變?chǔ)?細(xì)胞模型可以作為篩選特異性的Na/K-ATPase/Src受體復(fù)合物的激動(dòng)劑和拮抗劑的工具，來研發(fā)新型抗腫瘤，抗高血壓等心血管疾病藥物；同時(shí)我們