水稻線粒體ATP合成酶6kDa亞基基因的功能解析.pdf

1、該研究把碳酸鹽(NaHCO3、Na2CO3)對植物造成的逆境稱為"碳酸鹽逆境"(Carbonate stress).從水稻根cDNA文庫中篩選出一些與碳酸鹽逆境相關(guān)的基因,水稻線粒體ATP合成酶6kDa亞基基因(簡稱:RMtATP6基因)為其中之一.該基因編碼的氨基酸序列與Jansch等人(1996)從馬鈴薯(Solanum tuberosum)線粒體中純化的線粒體ATP合成酶6kDa亞基氨基酸序列(F1F0-ATP合成酶的F0部分)具

2、有同源性,但是這個小蛋白的功能尚不清楚,其基因也沒有被同定.在該研究中:這個基因被克隆(accession number:AB055076),在碳酸鹽逆境脅迫下它的表達特性被解析.RMtATP6基因編碼的蛋白預測分子量為6.578 kDa,預測的細胞內(nèi)存在位置為線粒體膜間間隙,結(jié)果預示了RMtATP6基因編碼的蛋白為水稻線粒體ATP合成酶6kDa亞基基因.Southern雜交結(jié)果表明RMtATP6基因是水稻核基因組中的一個單拷貝基因.通

3、過對RMtATP6基因在植物中的表達特性及在碳酸鹽逆境下在酵母中的功能解析,表明了該基因與碳酸鹽逆境有關(guān).將RMtATP6基因與綠色熒光蛋白GFP基因融合,構(gòu)建到酵母表達載體pYES2中,通過電轉(zhuǎn)化法將pYES2-RMtATP6-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母(Saccharomyces cerevisiae)INVScl中,并將轉(zhuǎn)化的細胞用熒光染料Mito Tracker Red CmxRos(Molecular Probes)染色,利用激光共聚

4、焦顯微鏡(Confocal Laser Scanning Biological Microscope,OLYMPUS)觀察,從而對RMtATP6基因編碼的蛋白在酵母細胞中進行定位.實驗結(jié)果證明:RMtATP6基因編碼的蛋白存在于酵母的線粒體中,這個結(jié)論與我們最初預測的RMtATP6基因編碼的蛋白在細胞內(nèi)的存在位置所得到的結(jié)果一致.為了更好的研究RMtATP6基因與碳酸鹽逆境的關(guān)系,將RMtATP6基因克隆到植物表達載體PBI121上,并

5、通過電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒PBI121-RMtATP6轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中,然后通過農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化煙草.經(jīng)過生根篩選、PCR檢測和Southern雜交檢測,證明RMtATP6基因已經(jīng)整合到煙草的基因組中.將RMtATP6基因克隆到原核表達載體pGEX-6p-3中,并將pGEX-6p-3-RMtATP6導入到Ecoli BL21菌株,經(jīng)IPTG誘導,得到一個分子量約32 kDa的RMt