低氧脅迫對鰱線粒體ATP酶活性及β、γ、δ亞基表達的影響.pdf

1、線粒體ATP酶是機體生命活動中供能的關(guān)鍵酶，它有F1和F0兩部分組成，在結(jié)合狀態(tài)下具有合成ATP的活性，而在分離狀態(tài)下具有水解ATP的活性，ATP的水解能夠驅(qū)動F1的轉(zhuǎn)動，跨膜的質(zhì)子流能促進F0的轉(zhuǎn)動，因此ATP酶通過F1和F0兩部分的有序配合，從而合成維持機體正常生命活動所需的能量供給。
　　鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)，俗稱白鰱、跳鰱、水鰱、鰱子，隸屬于鯉形目（Cypriniformes），鯉科（

2、Cyprinidae），是我國著名的四大家魚之一，已成為我國主要養(yǎng)殖的淡水魚類之一。鰱由于性情活潑，喜跳躍，耐低氧能力較差，環(huán)境劇烈變化時易發(fā)生大水面積的浮頭泛塘現(xiàn)象，因而選育耐低氧鰱品種（系）已經(jīng)成為鰱新品種選育的重要研究課題之一。低氧狀態(tài)下，由于供氧不足，線粒體中的氧化磷酸化反應(yīng)受阻，不能及時有效的合成ATP，造成能量代謝受阻，無法滿足魚體對ATP正常的生理需求，魚類游動緩慢，當(dāng)缺氧嚴重時，會導(dǎo)致魚類的死亡。
　　本文旨在通過

3、RACE技術(shù)對鰱線粒體ATP酶F1部分β、γ、δ亞基基因的克隆，采用SYBR-greenⅠ熒光定量PCR技術(shù)對其在低氧脅迫過程中鰱各組織中的表達，及通過寡霉素抑制法對鰱線粒體ATP酶活性的變化情況等進行分析，為進一步闡明鰱低氧脅迫下線粒體ATP酶及F1各亞基的反應(yīng)機制提供一定的理論數(shù)據(jù)。本研究的主要實驗結(jié)果如下:
　　1.低氧脅迫對鰱線粒體ATP酶活性的影響
　　隨著水體溶氧(DO)的逐漸降低，鰱心臟、腦、肝、脾和肌肉中線粒

4、體ATP酶活性均呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，但不同組織中的變化情況不盡相同。當(dāng)DO為3.37mg/L時腦組織中線粒體ATP酶活性達到最高值，且顯著高于正常溶氧情況下的表達水平;心臟和肌肉組織在DO為2.11mg/L時ATP酶活性達到最高峰值，均顯著高于正常溶氧時的表達水平;當(dāng)鰱出現(xiàn)浮頭現(xiàn)象時(DO:1.12mg/L)其肝和脾臟組織中線粒體ATP酶活性出現(xiàn)最高峰值，顯著高于正常溶氧時的表達水平。
　　2.鰱線粒體ATP酶β基因cDNA的

5、克隆及表達
　　鰱線粒體ATP酶β基因cDNA序列全長為1768bp，開放閱讀框(ORF)為1557bp，編碼518個氨基酸。β是一個保守基因，其氨基酸序列與鯉魚的同源性達到了99％，與斑馬魚、青鱂、尼羅羅非魚、紅鰭東方鲀等分別為98％、98％、97％、97％。隨著DO的降低，鰱心臟、腦、肝、脾和肌肉組織中F1-β基因mRNA的表達呈先升高后降低的趨勢。當(dāng)DO從正常溶氧降低到2.11mg/L過程中，β基因在心臟和腦中的表達量顯著升

6、高(P＜0.05)，之后隨著DO的繼續(xù)降低呈現(xiàn)急劇下降;肝、脾和肌肉中當(dāng)DO降低到3.37mg/L過程中β的表達顯著升高（P＜0.05），之后急劇下降(P＜0.05)。
　　3.鰱線粒體ATP酶γ基因cDNA的克隆及表達
　　鰱線粒體ATP酶γ基因cDNA序列全長1154bp，ORF為879bp，編碼292個氨基酸。其氨基酸序列與斑馬魚的同源性達93％，其次與鯉、藍鯰魚、斑點叉尾鲴、大西洋鮭魚等分別達92％、92％、91％、

7、86％。隨著DO的降低，在腦、肝和肌肉中γ基因的表達呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，當(dāng)DO為2.11mg/L時，腦和肝臟中γ基因表達量最高，顯著高于正常溶氧下的表達(P＜0.05），而在肌肉中，當(dāng)DO為3.37mg/L時γ表達量最高，且顯著高于正常水平(P＜0.05）;心臟中γ基因的表達呈逐漸降低趨勢，顯著低于正常表達(P＜0.05);相反在脾中則呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。
　　4.鰱線粒體ATP酶δ基因cDNA的克隆及表達
　　鰱線粒體

8、F1-δcDNA序列全長為762bp，ORF為480bp，編碼159個氨基酸。其氨基酸序列與斑馬魚的同源性最高，達到了91％，與大西洋鮭、羅非魚、櫻花鉤吻鮭、紅鰭東方鲀等的同源性分別為84％、85％、84％、84％。隨著DO的逐漸降低，鰱F1-δmRNA的表達在心臟中呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，且與正常溶氧情況下的表達相比，有顯著差異(P＜0.05);在腦、肝、脾和肌肉中的表達先呈現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象，且與正常DO下的表達有顯著差異（P＜0.05），隨后

9、表達下調(diào)與正常DO組無顯著差異，其中在肝和脾組織中當(dāng)其表達量達到最高時，顯著(P＜0.05)高于正常DO組數(shù)十倍。
　　5.ATP酶活性與F1復(fù)合體中β、γ、δ亞基的關(guān)系
　　由以上實驗結(jié)果可知鰱線粒體ATP酶F1復(fù)合體中β、γ、δ亞基均具有高度的保守性，ATP酶中具有催化作用的β亞基，隨著DO的逐漸降低，其表達變化與ATP的活性的活性的變化一致，β亞基的表達變化可反應(yīng)出ATP酶活性的變化。γ、δ亞基的表達均受到DO降低的影