高溫脅迫對西花薊馬抗氧化酶活性的影響及CAT基因的克隆與表達(dá).pdf

1、西花薊馬是為害園藝作物和經(jīng)濟(jì)作物的世界性害蟲。該蟲子2003年首次在北京發(fā)現(xiàn)，之后迅速蔓延至我國的大部分地區(qū)，為害日益嚴(yán)重。西花薊馬在入侵過程中，常常遭受夏季高溫脅迫，但這并未能限制其種群的快速擴(kuò)張。本文采用生理生化和分子生物學(xué)的方法，分析抗氧化酶系統(tǒng)在高溫脅迫條件下的作用，以了解西花薊馬對高溫脅迫的耐受機制，為西花薊馬種群擴(kuò)散研究提供理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.研究了高溫脅迫對西花薊馬抗氧化酶活性的影響。結(jié)果表明，西花

2、薊馬受到0.5、1和2h的高溫脅后，超氧化物歧化酶、過氧化物酶和過氧化氫酶的活性顯著升高而后降低;谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的活性則在0.5h高溫處理條件下顯著升高，而在1和2h高溫脅迫下活性變化不顯著。說明西花薊馬抗氧化酶系統(tǒng)能夠有效抵御高溫脅迫對其造成的氧化損傷。
　　2.通過RT-PCR技術(shù)克隆了7個西花薊馬內(nèi)參基因的部分片段，包括18S rRNA、EF-1、GAPDH、H3、TUB、ACT和RPL32。利用qRT-PCT技術(shù)研究

3、了西花薊馬7個內(nèi)參基因在不同實驗條件下的穩(wěn)定性，運用常用的內(nèi)參基因篩選程序(NormFinder、geNorm和BestKeeper)以及比較ACt法對各內(nèi)參基因進(jìn)行了排名，最后使用RefFinder網(wǎng)頁程序進(jìn)行綜合評估，得出最佳的內(nèi)參基因方案。最合適的內(nèi)參基因組合如下:不同發(fā)育階段為EF-1和RPL32;高溫脅迫為RPL32和GAPDH;低溫脅迫為18S和EF-1;高溫時間梯度為TUB和GAPDH;低溫時間梯度為EF-1和TUB。最后

4、，對篩選的內(nèi)參基因進(jìn)行驗證，表明內(nèi)參基因的篩選對目的基因定量研究標(biāo)準(zhǔn)化非常必須。
　　3.采用RT-PCR和RACE的方法從西花薊馬中克隆得到過氧化氫酶基因，命名為FoCAT。FoCAT的cDNA全長為1870bp，開放閱讀框為1521bp，編碼506個氨基酸，預(yù)測分子量為57.11kda。序列分析表明，F(xiàn)oCAT十分保守，與其他昆蟲的CAT具有很高的相似性，F(xiàn)oCAT具有兩個CAT家族的簽名序列，這也表明FoCAT屬于CAT基因

5、家族的一員。采用實時定量PCR研究了西花薊馬過氧化氫酶基因在不同發(fā)育歷期和不同溫度條件下的表達(dá)模式。結(jié)果表明高溫脅迫能誘導(dǎo)CAT的表達(dá)，而低溫脅迫對CAT表達(dá)的影響不顯著;CAT在西花薊馬二齡若蟲階段表達(dá)量顯著高于其它齡期的表達(dá)量;不論是高溫還是低溫不同時間梯度處理均導(dǎo)致CAT表達(dá)量顯著上調(diào)，且在處理2h達(dá)到最高值。
　　綜上所述，西花薊馬能夠耐受較強的高溫脅迫是其迅速入侵?jǐn)U散的重要基礎(chǔ)，其內(nèi)在機制可能與抗氧化酶系統(tǒng)抵御高溫脅迫免